生化制药重点.doc

生物制药的基本技术 一，基本制造方法：1、提取法2、发酵法3、化学合成4、组织培养法5、现代生物技术。 生化制药的六个阶段 ：1. 原料的选择和预处理 2. 原料的粉碎3. 提取：从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程。4. 纯化：粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心 、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。5. 浓缩、干燥及保存6. 制剂：原料药（精制品）经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。 二，生化药物提取的一般工艺流程:生物材料、发酵或培养液↓预处理（清洗、加热、调pH、凝聚、絮凝）↓细胞分离（沉降、离心、过滤）↓细胞↓细胞破碎（高压均质处理、研磨、溶菌处理）↓收集上清液↓初步纯化（沉淀、吸附、萃取、过滤）↓高度纯化（离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、吸附色谱及电泳等）↓成品加工（无菌过滤、超滤、浓缩、冷冻干燥、喷雾干燥、结晶等）.。 三，原料选择的基本准则：1、在大量的信息资料和实践经验的基础上，选择目标原料。2、选择有效成分含量高的新鲜材料；3、来源丰富易得；4、制造工艺简单易行；5、成本比较低；6、原料的采集不破坏生态环境, 选择对环境友好的原材料资源，防止生物入侵。 四，原料预处理方法：1、动物组织先要剔除结缔组织、脂肪组织等非活性部分；植物种子去壳除脂；微生物要进行菌体与发酵液分离等基本操作。便于贮存和运输。2、冷冻法预处理：有些材料要冷冻保存或低温保存，以便抑制微生物和酶的作用。3、有机溶剂除去部分水分：用丙酮或乙醇进行脱水和脱脂，有利于贮存。 五，原料的粉碎（3点）：动物脏器组织：常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织：常用磨碎法；微生物：常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声、加压等 处理方法。1.机械法：组织捣碎机、匀浆器、研钵、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机、刨片机。动物组织多在冰冻状态绞碎、溶浆。2.物理法：A、反复冻融法：把待破碎的样品冷至-20℃-15℃ ，使之凝固，然后缓慢的溶解，如此反复操作，大部分动物性细胞及细胞内的颗粒可以破碎。B、冷热交替法：将材料投入沸水中，在90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。此法多用于细菌或病毒中提取蛋白和核酸。C、超声波处理法：多用于微生物材料，处理的效果与 样品浓度、使用频率有 关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用50~100mg/L菌体浓度，在1~10KC频率下处理10~15min。操作时注意避免溶液中气泡的存在。D、加压破碎法：加气压或水压，达0.59~34.32MPa (210~350kgf/cm2)的压力时， 可使90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。3.生化及化学法：A. 自溶法：将新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料在0-4℃ ，微生物在室温下。自溶时，需加少量的防腐剂，甲苯、氯仿，以防止外界细菌的污染。B.溶菌酶处理法：溶菌酶是专一地破坏细菌细胞壁的酶。多用于微生物，对蜗牛酶、纤维酶及植物细胞也适用。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8.0的0.1mol/L Tris-0.01mol/L EDTA 制成 2 亿/ml的细胞悬液，然后加 入100μg~1mg的溶菌酶，在37 °C保温10min，细菌胞壁即被破坏。C. 表面活性剂处理法：表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。常用有：SDS、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠。 六，提取条件的选择：1、溶剂:常用水、稀盐、稀酸、稀碱，有机溶剂如乙醇、丙酮、氯仿、四氯化碳、丁醇等。丁醇提取的pH、温度范围较广（pH3-6, -2-40℃）。适用于动植物和微生物原料。2、pH : 与溶解度和稳定性有很大关系，一般选择在 pI 的两侧。3、温度：一般在4 ℃ 以下，但对温度耐受力较大的药物，可适当的提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提取和纯化。如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶及多肽激素类，选择37-50 ℃ 提取，效果较好。 七，分离纯化（7点）：1、盐析法：利用不同的蛋白质在高浓度盐溶液中，溶解度不同程度的降低来进行分离纯化。在低盐浓度下，溶解度随着盐浓度升高而增加，称盐溶作用；当盐浓度不断升高时，不同蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出沉淀，称盐析作用。A优点：设备和条件要求低，安全应用范围广泛。在高盐情况下，蛋白质不易发生变化，一般在室温下操作。B缺点：分级分离能力不高。C常用的中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠。D盐析时应注意的几个问题：（1）盐饱和度：由于蛋白质的结构和性质不同，盐析要求的饱和度也不同。要按工艺要求，正确计算饱和度。（2）pH