免疫组化知识技巧.doc

免疫组织化 免疫组织化学 ????????免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它 是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。 1．发展简史 ——1941年Coons 首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 ——60年代Nakane建立酶标抗体技术——铁蛋白标记Ab技术。 ——70年代Stemberger 改良上述技术，建立辣根过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。 —— 80年代 Hsu 等建立了抗生物素—生素（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。 —— 90年代??分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。 ——2000年??各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。 2．免疫组织化学的技术分类 （1）根据染色方式分成：贴片染色；漂浮染色。 （2）根据Ag—Ab结合方式分成：直接法；间接法；多层法。 （3）按标记物的性质分成： 免疫荧光技术（免疫荧光法）； 免疫酶技术（酶标抗体法、桥法、PAD法、ABC法）； 免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）。 3．标记物 （1）必要性：组织细胞内Ag—Ab结合反应一般是不可见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。 （2）常用标记物 ??????????荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC） —— 荧光显微镜下呈绿色荧光四乙基罗达明（rho—damine RB200）——荧光显微镜下发橙红色荧光； ??????????酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ??????????生物素：（Biotin） ??????????铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 ???????其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用） 4．应用 ????????凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。最近几年，分子生物学研究异常活跃，但最终还要归到形态上来。用免疫组织化学方法对所研究的大分子分子进行定位，进而深入研究其功能。 ? 一、免疫组织化学技术 （一）染色方法 1．直接法 ???????荧光素直接标记特异性抗体（—抗）上，标记抗体与抗原结合（在切片上）荧光显微镜下观察→检测抗原。 ???酶标抗体要显示后镜检。 ? ? ? ? ? ?  直接法优点：简单，时间短，特异性强。缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。应用：基本不用了！！2．间接法????????荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。 显色后镜检????????特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→鉴定多种抗原。 ? ? ? ? ? ?  3．非标记Ab桥法： ???????“桥法”是酶标记抗体的改进，经过三次抗体，其二抗为未标记桥抗体。 （1）单桥法 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?  (2)双桥法 ???????在三抗之后，将二抗和三抗再重复一次，可增大染色强度。 特别提示：注意动物种属关系 4．PAP法（过氧化物酶—抗过氧化物酶法 ????????Peroxidase anti—peroxidase method， PAP法）~ 是桥法的改良，既先形成PAP复合物→抗原—抗体—抗IgG抗体—PAP复合物。 ? ? ? ? ? ? ? ? ?  该法简化了操作步骤，提高了灵敏度，所染标本可长期保存。 ? 5．ABC法（亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法，Avidin—biotin—peroxidase Complex???method，ABC法） ???Avidin：??亲和素，一种糖蛋白，其上有4个与生物素相结合的位点。 ???Biotin ： 生物素—维生素H，两者亲和力巨大，牢不可破。 ABC法与PAP法的区别是：以ABC复合物代替PAP复合物。 （1）ABC复合物的制备： ? ? ? ? ? ?  （2）ABC法反应原理 ? ? ? ? ? ? ? ? ?  6．SP或SAP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素或过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）Streptavidin/peroxidase or strepta-vidin/alkaline phosphatase） ????????该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，而后再结合PO