大肠杆菌DH5a感受态细胞转化率的改进剖释.doc

大肠杆菌DH5α感受态细胞转化率的改进 桓明辉 摘要：针对实验材料E．coli DH5α，对该茵株在不同生长时期的转化效率进行测定，确立了一个能制备高转化率感受态细胞的实验方案。结果表明：在细茵的生长繁殖过程中，其转化率有很大变化；结果：得到了E．coil DH5α茵株制备感受态细胞的最佳条件。 关键词：大肠杆茵；感受态；转化率 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。感受态细胞的制备和转化是分子生物学实验室频繁使用的一项重要的常规操作。对细菌而言，为达到高效转化，活细胞数务必少于l08细胞／m1。对于大多数E.coli来说，相当与OD600为0.4左右，但由于转化是一个很复杂的过程，具体的作用机理仍在探究中。有文献指出[1]，细菌的最佳感受态细胞制备期对于不同菌株是不同的，并不一定都是在活细胞浓度为l08细胞／ml的时候最适宜，有必要针对所使用的菌株确定其最佳转化条件。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 菌株与质粒：E．coli DH5α，pUC18质粒由本实验室保存。 X-gal，IPTG，LB培养基，氨苄青霉素溶液，0.1 mol／L CaCl2溶液，均按《分子克隆实验指南》的要求配制。 1.2 方法 1.2.1大肠杆菌生长情况的测定： 从平板上挑取单个菌落(直径2～3 mm)到含有30ml LB培养基的锥形瓶中，37℃下250 r／min培养过夜。取出0.3 ml培养物到含有l5 ml LB培养基的摇菌试管中，继续振荡培养，每隔20 min取出一支摇菌试管，放于冰箱．统一测定菌液的OD600，绘制生长曲线。选取几个不同时相的菌液倍比稀释从lO-1 ～lO-6，各取0.1 ml稀释液涂布LB平板培养基，37℃正向培养1 h后，倒置培养l2～16 h。每个稀释度铺3个平板，计数，作OD600一活菌细胞浓度图。 1.2.2 标准质粒制备[4] 利用裂解法抽提pUC18质粒，琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察，将显示为超螺旋DNΑ带型的凝胶切下，利用透析袋法进行回收后，电泳确保质粒全部为超螺旋状态，测定其浓度及纯度， IE缓冲液稀释为0.05μg/ml，保存于-20℃。 1.2.3 大肠杆菌感受态细胞制备及转化 37℃下250 r／min培养过夜的大肠杆菌培养物，按1：40接种于l5 ml LB培养基的摇菌试管中，继续振荡扩大培养．根据生长曲线，每隔一定时间取一支菌液，测定OD600后,1.5ml转入l0 ml无菌离心管，冰浴中冷却10 min，4℃ ，40OO r／min离心10 min，弃上清，用1／2体积的预冷0.1 mol／L CaCl2，溶液悬浮细胞，冰浴中放置30 min，4℃，4OOO r／min离心10 min．根据OD600一活菌细胞浓度图，加入一定体积的0.1mol／L CaCl2溶液，调整细胞浓度为2.5×109细胞／ml，取200μl感受态细胞，分装到1.5ml无菌离心管，4℃保存过夜．加入0.1g质粒DNΑ，冰浴30 min后42℃热休克60～90s，冰浴中迅速冷却2～3 min，加入0.8 mlLB培养基，37℃低速振荡培养1 h，室温，40OO r／min离心5 min，吸去0.9 ml培养基，混匀剩余培养物，全部涂布在加有X-gal，IPTG及氨苄青霉素的LB平板培养基上，37℃正向培养1小时后，倒置培养l2～16 h，每个时相涂布9个平板．并以未加质粒DNΑ的转化液作对照。 2 结果与分析 2.1 E．coil DH5α的生长曲线 在菌株与菌株之间，O 值与每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测定特定E．coli的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600，从0～10 h，测定细菌不同生长时期的OD600，绘制生长曲线．为保证细菌培养物的生长密度不至过高，应每隔l5～20 min检测OD600(表1)。得到E．coli DH5α的生长曲线(见图1)，以便预测培养物的OD600达到0.4的培养时间。如图1所示，该生长曲线主要包括了E.coli DH5α在37℃培养条件下群体生长周期中的迟缓期、对数期及稳定期初期。 表1 E．coli DH5α的生长曲线 序号 时间（min） OD600 序号 时间（min） OD600 1 0 0.052 11 200 0.620 2 20 0.069 12 220 0.720 3