实验-植物DNA提取及检测 -cc精要.pptVIP

DNA分子量标准 1.凝胶制备 制备1%琼脂糖凝胶。称取0.8g琼脂糖加入 80mL 1×TAE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃ 时,缓慢倒入胶板，迅速加入 EB 8μl，混匀，排气泡，插上梳子，待胶凝固后拔出。 2.加样 取4μl DNA样液与 2μl 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。 4.观察拍照 四、操作步骤 * 植物总DNA的提取 主讲人：陈晨 植物基因组DNA的提取 一 、实验目的 学习并掌握植物基因组DNA的提取原理和方法 脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。 二、实验原理 细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸 基本过程 ①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用SDS处理细胞； ③酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 细胞破碎 SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。 DNA提取 蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 DNA纯化（去杂质） 实验材料 植物叶片(硅胶保存) 试剂 2×CTAB抽提液（CTAB、Tris-HCL、EDTA、NaCl） TE 缓冲液(pH=8.0) 氯仿：异戊醇(24:1) 巯基乙醇 异丙醇 75%乙醇 NaCl NaAc 三、材料与试剂 ①离心机 ②水浴锅 ③研磨机 ④微量移液器 仪器用具 1．取干燥的植物叶片约0.1g于DNA粉碎管中，在Fastprep植物组织破碎仪上震荡30s，仪器参数为Speed4.5 2. 在粉碎好的样品中加入1ml CTAB抽提液【2%CTAB、100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、20mmol/L EDTA、1.4mol/LNaCl】（用之前提前与1μl巯基乙醇在提取前混合），摇匀，65℃水浴中加热25min，每隔5min左右摇动离心管。 3. 取上清与2ml离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀10min，防止成团。10000r/min，离心10min。 4. 取上清加入1/10体积的CTAB/NaCl[10%CTAB,0.7mol/LNaCl],摇匀后加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），用手轻轻摇10min，10000r/min，离心10min。 四、操作步骤 5. 取上清加入1/2体积5mol/L NaCl,然后加入1体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动混匀两相，-20℃静置1h，待DNA析出，10000r/min，离心10min，弃水相。 6． 400μl 75%乙醇洗涤两次，无水乙醇洗涤一次，去乙醇，风干。 7. 100μl TE缓冲溶液溶解DNA。 7. 用200μl高盐TE溶解DNA，在DNA完全溶解后加入RNA酶至终20μg/ml，37℃保温1h 8. 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），摇匀成乳白色，10000r/min，离心10min 9. 取上清加入1/10体积3 mol/L NaAc和两倍体积的无水乙醇，轻轻摇匀，静置于-20℃ 30min,直到出现DNA絮状沉淀，8000r/min，离心10min，弃上清，用200μl 75%的乙醇洗涤两次，200μl无水乙醇洗涤一次，去乙醇，分干。 10. 100μl TE缓冲溶液溶解DNA。 1)研磨要彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀； 2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2－5％），尽可能选取幼嫩的材料； 3)收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难； 4)为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防