菌种冷冻保藏技巧.docVIP

菌种冷冻保藏 菌种保藏对于生物制药是一项重要的基础工作。要使菌种长期保藏，且其生物学性状和遗传性质不变，必须选择适宜的载体和更稳定的保藏方法。菌种保藏无论哪种方法，其原理都是创造一个抑制细胞代谢的环境，即低温、干燥、缺氧、缺乏营养，使新陈代谢活动处于高度静止状态。在众多的菌种保存方法中，相对所需保藏环境，冷冻真空干燥法（即冷冻管保藏）是目前保藏方法中应用最为广泛最为有效的一种。 1、冷冻真空干燥保藏原理 冷冻真空干燥保藏法可使细胞或孢子水分在冻结状态下直接升华而干燥。冷冻管保藏的三要素：真空——降低水的蒸汽压以加速水分的蒸发；冷冻——使水蒸气冷凝以减轻真空泵负荷，加速干燥；低温——达到进一步加速干燥的目的。 2、冷冻干燥的优点： 对微生物的生物活性影响小；所得干粉疏松，溶解性好；水分含量低。 由于同时满足菌种保藏三要素，使微生物始终处在低温、干燥、缺氧的条件下，能克服传代、沙土管简单保藏方法的不足，保藏菌种范围广、时间长（保藏期可达数年至十数年）、存活率高、保存过程不易失活和退化等。 3、主要步骤为： 3.1将待保藏菌种的细胞或孢子悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中； 3.2在低温（-45℃以下）下使微生物细胞快速冷冻； 3.3在真空条件下使冰升华，以除去大部分的水分； 3.4封口使菌种始终处于真空缺氧状态； 3.5冷藏创造低温、干燥的保藏环境。 4、材料 菌株： 筛选出具有优良性能的菌株。 试剂： 2% HCl；脱脂牛奶（20%乳液）、 器具： 培养皿、接种环、250 ml三角瓶、高压蒸汽灭菌锅、牛皮纸、酒精喷灯、恒温培养箱、酒精棉球、泪滴型安瓿管、标签、长颈毛细玻璃管、普通棉、冻干机。 培养： 种子液体培养基、斜面或平板培养基。 5、主要流程 备泪滴型安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→封管→保藏 6、操作方法 6.1准备安瓿管 选取质地均匀、无毛点、无气泡的中性硬质玻璃专用菌种冷冻管，形状为长颈球形底（亦称泪滴型安瓿管），规格约外径6～7.5mm，长105mm，球部直径9～11mm，壁厚0.6～1.2mm。先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；管口塞上棉花，用牛皮纸包扎，1.05kg/cm2，121℃灭菌30分钟，取出置37℃孵育24小时，重复灭菌一次，105~110℃烤干（有硅胶指示剂的要使硅胶达到深蓝色），置干燥器内备用。 6.2制备脱脂乳 取市售新鲜、清洁、无抗生素污染的原牛奶300ml煮沸，在5000 r/min下离心10分钟，除去上层奶皮、油脂，吸取下层奶液，经脱脂棉过滤，如此反复3次脱去脂肪，然后分装入两个250 ml三角瓶中，加棉塞并用牛皮纸包头、扎牢，在115℃25min高压蒸汽灭菌，冷却后做无菌试验，4℃冰箱保存备用。 也可以购买袋装或盒装的超高温灭菌优质脱脂牛奶直接使用，无需再灭菌。还可将脱脂奶粉制成还原乳，配成20%乳液，同上灭菌后使用。 如灭菌后放置时间超过24小时，则应弃用。 6.3菌种准备 菌种要求为筛选得到的优质良种，生长良好的纯种，孢子新鲜，菌龄以处于稳定期或超过对数生长期为好，有利于延长冻干存活期。放线菌斜面种子培养7～10天，生长饱满，孢子丰富，且无菌检查合格。 6.4制菌悬液 形成孢子的链霉菌要尽可能保存孢子，避免基质菌丝体。 每支长好的斜面加5～10ml脱脂牛乳，用接种环将孢子轻轻刮下(注意勿刮起培养基)，或震荡洗下孢子层，制成菌悬液。一般要求制成的孢子浓度达108~1010个，高浓度的菌悬液有利菌种保藏。多年后存活率仍高。? 6.5分装 菌悬液制备完成后要尽快分装。分装冷冻管时用灭菌的长颈毛细吸管吸取菌悬液，插入预先的冷冻管球形底部，每支冷冻管分装量约0.2～0.5毫升，分装后向管颈部塞入无菌脱脂棉，以不紧为宜。并贴上标签，同时配制1支1%氯化钴牛奶溶液干燥指示管。分装时间要短，要尽快进入冻结。 6.6预冻 因为迅速超低温预冻可保持菌体细胞结构成份原状，利于细菌存活。故将分装好的冷冻管及指示管置于低温冰箱冷冻室-70℃下快速冷冻过夜。无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。也可用液氮。将冷冻管插入冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。也可用液氮预冻。还可用低温冰箱-80℃预冻1～2小时后转入冷冻真空干燥。 6.7?冷冻真空干燥 真空冷冻干燥器有成套的装置出售（长药厂新近成立菌种中心，购有该机）。按其方法操作。冷冻干燥机要先开机预冷30分钟以上，再根据冷冻干燥机的水分蒸发能力，确定一次放入的冷冻管数量。将预冻好的冷冻管及指示管于次日取出迅速放入已预冷的冷冻干燥机的干燥箱内，开动真