western+blotting实验操作步骤分解.docVIP

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB） WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A第一部分：蛋白样本提取制备 蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项： 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）； 保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）； 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）； 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）； 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 方法的选择 自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取 ； 购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取 。 Example 1： 实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下： 提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）； 配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）； 裂解组织：