连接产物的转化详解.ppt

连接产物的转化 1、puc19质粒用HindIII和EcoRI酶切，线性化； 2、目的片段用HindIII和EcoRI酶切，线性化； 3、回收酶切后的质粒和目的片段，定量,连接； 一 实验目的 掌握细菌转化的一般技术和原理。 二 实验原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。使受体细菌从周围介质中吸收外来DNA分子，从而获得新的遗传物质的过程就是转化。 通常所用的受体是大肠杆菌。 用于转化的细菌被称为感受态细胞。 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5x106~2x107 转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆实验。如在Ca2+ 的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+ 、Co2+ ）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。 大肠杆菌的转化常用热激法，该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 除热击法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。 DNA分子转化分以下几步: 1. 吸附－－双链DNA分子吸附于受体菌表面； 2. 转入－－双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； 3. 自稳－－外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链； 4. 表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译 重组子的筛选 抗生素标记法：菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡那霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 互补法：现在使用的许多载体（如PUC系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端aa的序列。β－半乳糖苷酶表达， 在底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。 实验步骤： 1）将2μl连接产物与100μl感受态细胞在冰上混匀，并静置30min，42℃下处理60sec，然后加入600μl的LB（A-）液体培养基，在摇床上37℃摇动培养1hr。 （2）(在LB（A+）平板上涂布40μl的X-gal和4μlIPTG溶液)待完全吸收后，将转化产物离心后悬浮，涂平板。37℃过夜培养。