五味子酯甲抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性评价.docVIP

五味子酯甲抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性评价 　　[摘要]探讨五味子酯甲对肝窦内皮细胞细胞功能及血管新生的影响。0～40μmol?L-1五味子酯甲与SK-HEP-1细胞孵育24h，MTT法评估五味子酯甲对SK-HEP-1细胞活力的影响。血管内皮生长因子（VEGF）诱导SK-HEP-1增殖，以VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼为对照，同时设空白对照组，五味子酯甲与SK-HEP-1细胞孵育，EdU法检测细胞增殖；荧光探针法检测胞内NO含量和NOS活性；细胞迁移、Matrigel管腔形成实验检测细胞管腔形成；大鼠主动脉环实验检测血管生长变化；转基因斑马鱼实验观察斑马鱼节间血管、功能血管数变化。与空白对照组比较，VEGF诱导SK-HEP-1细胞增殖、NO含量和NOS活性升高；与模型组比较，五味子酯甲显著抑制VEGF诱导的SK-HEP-1细胞增殖、降低NO含量和NOS活性。五味子酯甲能够显著抑制VEGF诱导的SK-HEP-1细胞迁移和管腔形成，抑制大鼠主动脉环血管形成；对转基因斑马鱼节间血管具有显著抑制作用，显著减少斑马鱼功能血管数量。五味子酯甲能够抑制内皮细胞功能，且具有抑制血管新生活性的作用。 　　[关键词]五味子酯甲；肝窦内皮细胞；血管新生；肝纤维化 　　血管新生是指在原有血管结构的基础上通过芽生或套叠增生的方式形成新血管的生物学过程。肝脏在生理和某些病理情况下均可见到血管新生，生理性见于肝脏再生，病理性可见于肝纤维化、肝硬化。研究表明血管新生与慢性肝炎、肝纤维化进程有关，甚至是其促进因素。血管新生是肝纤维化的关键病理变化，能促进细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）生成、门脉高压的产生，现已证实抗血管新生治疗可有效阻止肝纤维化进展。肝窦内皮细胞（liver sinusoid endothelial cell，LSEC）是肝纤维化血管新生的细胞学基础。五味子味酸，甘，性温，具有收敛固涩、补肾宁心、益气生津等功效，含木脂素类、三萜类、倍半萜类、生物碱类、有机酸、挥发油等多种化学成分，五味子酯甲是木脂素类成分之一，能直接吸收入血，发挥抗肝纤维化作用。本研究采用血管内皮生长因子（vascular en-dothelial growth factor，VEGF）诱导SK-HEP-1细胞增殖、细胞迁移与管腔形成、大鼠主动脉环实验与斑马鱼模型，进一步评价五味子酯甲抑制肝窦内皮细胞功能及血管新生的活性。 　　1 材料 　　五味子酯甲购自上海融禾医药科技发展有限公司；索拉非尼（sorafenib），VEGF/PDGF受体酪氨酸激酶及丝/苏氨酸激酶抑制剂购自Bayer公司。 　　SK-HEP-1细胞株（ATCC Number：HTB-52TM）购自中国科学院上海细胞库，为内皮来源人肝癌细胞株。 　　SD大鼠，6～7周龄，SPF级，购于中国科学院上海实验动物中心，许可证号SYXK（沪）2007-0005。 　　Minimum Essential Medium（MEM），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自GIBCOTM公司；二甲基亚砜（DMSO），Fibronectin噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司；Recombinant Rat Vascular Endothelial GrowthFactor（VEGF Rat）购自Prospe公司；EdU细胞增殖试剂盒（Cell-LightTM EdU DNA Cell Proliferation Kit）购自广州锐博生物科技有限公司；NO荧光探针，NOS试剂盒，结晶紫染液购自碧云天生物技术研究所。Matrigel购自BD Biosciences公司。Transwell24孔板购自美国Coming公司。 　　2 方法 　　2.1 细胞培养 SK-HEP-1细胞以10%FBS/MEM培养液培养，每3～4d传代1次。 　　2.2 药物配制 ①每1L MEM培养基含MEM干粉1袋，NaHCO，2.2g，4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）2.38g，青霉素0.0625g，链霉素0.1g。②胰酶1L含Trysin 2.5g，乙二胺四乙酸（EDTA）0.2g，NaCl8g，KCl 0.4g，Na2HPO4?12H2O 0.134g，KH2PO4 0.06g，NaHCO30.35g。③L-谷氨酰胺100mL：L-谷氨酰胺2920mg加ddH2O至100mL。④PBS缓冲液1L含NaCl8g，KCl 0.2g，Na2HPO4?12H2O 3.58g，KH2PO4 0.26g。 　　2.3 细胞模型 SK-HEP-1细胞以每孔8000个接种于96孔板，待细胞长至亚单层，弃培养液，VEGF以0.4%胎牛血清稀释，20μg?L-1VEGF与SK