枯草芽孢杆菌发酵论文.doc

1 材料与方法 1.1材料 1.1.1菌种 实验室枯草芽孢杆菌 1.1.2培养基 （1）LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH为7，（可溶性淀粉20g）琼脂20g。 （2）筛选用培养基：含有2%可溶性淀粉的LB培养基。 （3）种子培养基：豆饼粉4%，玉米粉3%，NaHPO0.8%，(NH)SO0.4%，NHCl0.15%，HO。 （4）发酵培养基：豆饼粉5.6%，玉米粉7.2%，NaHPO0.8%，(NH)SO0.4%，NHCl0.13%，CaCl0.13%，α—淀粉酶50g。 1.1.3试剂 1mol/LNaOH，1mol/LHCl，盛9ml无菌水的试管6根，盛90ml无菌水的三角烧瓶，乙醇（75%），蒸馏水。 1.2方法 1.2.1 培养基的制备 (1)称量 按培养基配比依次准确地称取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入烧杯中，并在烧杯中加入少量蒸馏水。注：酵母膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，酵母膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 (2)溶化 可溶性淀粉溶液的配制方法：将所需克数的可溶性淀粉放入一个小烧杯中，加入少量蒸馏水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的沸水中，一边搅拌一边加热，待其溶化成透明状后继续在电炉上加热5分即制成可溶性淀粉溶液。 如果配制固体培养基时，将已准备好的可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，补水到所需的总体积。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按2%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。 在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不能用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。 (3)调pH 培养基配好以后，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直到pH达7为止；反之，用1mol/LHCl进行调节。 对于有些要求pH较精细的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。 注意：pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度，配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。 (4)分装 按照实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶中。 液体分装：分装的高度以试管高度的1/4左右为宜；分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶的一半为宜。 固体分装：分装于试管中的应不超过试管的1/5，灭菌后制成斜面；分装三角瓶的量以不超过一半为宜。 (5)加塞 培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 (6)包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，外边再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称，组别，配制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结扎好，使用时容易解开，同样注明。 (7)灭菌 将配置好且包扎完毕的固体、液体培养基及本实验涉及的试管、三角瓶等及400ml纯水于高压灭菌器中以0.14Mpa，121℃条件下高压蒸汽灭菌20分钟。 (8)斜面搁置 将培养基冷却至50℃左右时放置斜面，斜面在试管的1/2处为宜，待斜面凝固后，放置于冰箱中待用。 1.2.2菌种的筛选与保藏 (1)倒平板 将实验配制好的培养基加热溶化，待冷却至55—60℃时，倒平板9皿。 (2)稀释 用接种环取菌种，放入盛90ml无菌水的三角瓶中，振摇。用一支1ml无菌吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10、10、10、10、10、10不同稀释度的菌液。 (3)划线 将平板底面分别用记号笔写上10、10、10三种稀释度（共三组）然后用接种环分别沾取浓度为10、10、10稀释液并对号在相应平板上划线，室温下静止5—10min，使菌液吸附进培养基。 (4)培养 将培养基平板倒置于37℃的培养箱中，培养2—3天，观察淀粉圈。对有淀粉圈的菌落，测量淀粉圈的直径D，菌落直径，计算的比值，可进行拍照，选择淀粉圈较大的菌落作为后续实验的菌种。 (5)接种 接种到斜面培养基中，标注上日期等信息。放入恒温培养箱中培养作为一级种子。 (6)保藏 斜面置于37℃的培养箱中，培养2—3天，观察菌种长势好坏