蛋白质--高级生化课件解读.ppt

02 2、凝胶层析法 蛋白质分子量的 测定 大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱； 而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。 若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 * 02 2、凝胶层析法 蛋白质分子量的 测定 如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积VＯ，不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为时VＯ，出现洗脱峰。 　凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为VＯ+Vi时，出现洗脱峰。 * 02 2、凝胶层析法 蛋白质分子量的 测定 利用Andrews的实验经验式： lgMr = a/b—Ve/bVo 式中，Ve为洗脱体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰（峰顶）出现时所流出的体积。Vo为外水体积，Mr为相对分子质量，a和b为常数。 葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的物质。例如Sephardex G-75的分级范围是3000-80000的球形分子。在本实验中用于分离胰岛素（Mr为6000）和牛血清蛋白（Mr75000）。 * 02 2、凝胶层析法 蛋白质分子量的 测定 * 蛋白质 高级生物化学 姓名 * CONTENTS 01 · 蛋白质的分离与纯化 02 · 蛋白质分子量的测定 03 · 蛋白质含量的测定 * 01 蛋白质的分离与 纯化 1、根据蛋白质溶解度不同进行分离： 盐析法、等电点沉淀、低温有机溶剂沉淀法 2、根据蛋白质分子大小进行分离： 透析与超滤、凝胶过滤法 3、根据带电性质进行分离： 电泳法、离子交换层析法 4、根据配体特异性进行分离： 亲和层析法 * 01 蛋白质的分离与 纯化 利用蛋白质理化性质的差异，可以对蛋白质进行分离纯化。由于蛋白质容易变性，选择的方法要尽可能温和，通过多种分离方法的合理搭配，才有可能得到回收率和纯度较高的纯化蛋白质。 * 01 1、根据蛋白质溶解度不同进行分离 蛋白质的分离与 纯化 1.1盐析法： 在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。 加入中性盐 低盐盐溶 高盐盐析 基本原理 正常条件下，蛋白质呈稳定的分散状态 蛋白质为两性物质，表面电荷的静电斥力作用 分子表面的水化膜 * 01 1、根据蛋白质溶解度不同进行分离 蛋白质的分离与 纯化 1.1盐析法 无机盐的选择 （NH4）2SO4, MgSO4, Na2SO4, NaCl, Na3PO4等，最常用的是（NH4）2SO4 廉价 在水中溶解度大，而且溶解度随温度变化小，低温下也能盐析 对大多数蛋白质的活力无损害 * 01 1、根据蛋白质溶解度不同进行分离 蛋白质的分离与 纯化 1.1盐析法 盐析后处理 盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去。 常用透析法： 把蛋白质溶液放入透析袋内（常用玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断更换缓冲液。 在低温下进行。 也可用葡聚糖凝胶柱层析的办法。 * 01 1、根据蛋白质溶解度不同进行分离 蛋白质的分离与 纯化 1.2等电点沉淀 蛋白质在等电点状态时净电荷为零，颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小。可调节溶液的pH值达到某一蛋白质的等电点使之沉淀。 此法很少单独使用，可与盐析法和有机溶剂沉淀法结合使用。 * 01 1、根据蛋白质溶解度不同进行分离 蛋白质的分离与 纯化 1.3低温有机溶剂沉淀法 在蛋白质溶液中，加入与水互溶的有机溶剂后，具有相反电性的离子基团之间的吸引力增加，这就促使它们互相聚集，并沉淀出来。 近年来的研究认为，有机溶剂可能破坏某种键如氢键，使空间结构发生变化，致使一些原来包在内部的疏水集团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。 * 01 1、根据蛋白质溶解度不同进行分离 蛋白质的分离与 纯化 1.3 低温有机溶剂沉淀法 常用的有机溶剂有乙醇或丙酮。 如果同时将pH调到蛋白质的等电点使之沉淀，沉淀效率较高，但蛋白质较容易变