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生物素、亲和素标记技术
一、生物素及其理化性质
1 概念
2 分子式
结构特点
溶解特性
等电点
其它特性
1 概念：
生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。
分子式：
C10H16O3N2S 分子量：244.31
结构特点：
咪唑酮环/四氢噻吩环
结合亲和素 侧链末端羧基结合蛋白质
溶解特性：
难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF)
等电点：
PH=3.5
其它特性：
羧基需经活化修饰才能结合蛋白质
（羧基活化的生物素，称为活化生物素，也叫生物素衍生物）
生物素衍生物的种类及特性：
1 生物素羟丁酰亚胺酯(BNHS)：
DMF
制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺
二环己基碳二亚胺
标记特点：
BNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基
结合达到标记的目的
适用于：标记Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA
长臂活化生物素(BCNHS)：
DMF + 6-氨基己酸
制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺
二环己基碳二亚胺
(在BNHS的B与羧基之间插入2分子的6-氨基己酸 ）
标记特点: (同BNHS)
BCNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的
适用：(同BNHS) 标记Ab、酶、中性或偏碱
性的Ag、DNA
3 生物素酰肼(BHZ)：
制备：生物素 +水合肼
标记特点：
BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记
适用：标记偏酸性的蛋白质、酶、DNA
三、亲和素及其理化性质
1 概念
2 分子式
结构特点
溶解特性
等电点
其它特性
1 概念：
亲和素(avidin)：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化合物的碱性糖蛋白。
链霉亲和素：是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质
分子量：
A: 6.7KD
SA: 6~6.5KD
3 结构特点：
每分子由四个亚基组成
溶解特性：溶于水，C=5mg/ml
等电点： A: PH=10.5
SA: PH= 6.0
比活性： A≥12u/mgP
SA ≥14u/mgP
四、亲和素的活性及其测定
1 亲和素的活性：是表示亲和素结合生物素的能力，即：ugB/mgA或ugB/mgSA。
活性测定：
⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法：
A(SA) + HABA（红色） B A-B
（出现黄色时B的量）
⑵ 分光光度法：
五、生物素标记物及亲和素标记物的制备：
1 生物素标记物的制备：
B +Ab/Ag/E 交联剂 B-Ab/Ag/E
亲和素标记物的制备：
A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E
六、技术类型：
可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、间接法、竞争法等，在次基础上引入A-B系统。
BAB法：
Ag+B·Ab Ag-Ab·B A Ag-Ab·B-A
B·E Ag-Ab·B-A-B·E
特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
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BA法：
Ag+B·Ab Ag-Ab·B A·E Ag-Ab·B-A-B·E
特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省
却了加B-E的步骤
ABC法：
⑴ A+B·E A- B·E----------ABC
⑵ Ag+B·Ab Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-ABC
特点：将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC
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