高效液相色譜法.ppt

第一节 概述 高效液相色谱法： 它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。 一、HPLC的特点和实际应用 二、HPLC与GC差别 1．分析对象的区别 GC：对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测,可测占有机物的20% HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80% 2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 第二节 基本理论和条件选择 讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比） 2）涡流扩散项及其影响 1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp≤10μm） 首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相——甲醇， 约1ml/min 3. 柱温的选择：选室温250C左右 一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、离子色谱法（IC） 四、空间排阻色谱法（SEC） 五、高效逆流色谱（HSCCC） 1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异 3．流动相：底剂（烷烃）+ 有机极性调节剂 例： 正己烷或庚烷 + 氯仿- - - 注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间 4．出柱顺序：弱极性组分先出柱，强极性组分后出柱 5．硅胶吸水量↑，LSC→LLC 硅胶含水量较小 吸附色谱 硅胶极性较大 硅胶含水量17% 分配色谱 硅胶失活→载体 吸附的水→固定液 1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异 2．正相色谱与反相色谱 正相色谱——固定液极性 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分：甾醇、类（磷）脂化合物、脂肪酸 反相色谱——固定液极性 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 理想的、普遍适用的分析方法，同族化合物 （有机化合物都存在疏水基团） 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） 特点： 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱 1）反相键合相色谱 固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题） 流动相： 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF 适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题） （1）反相离子对色谱法（IPC或PIC） 反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离 适用：较强的有机酸、碱 （2）反相离子抑制色谱 在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的 1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液 2）调节pH范围：3.0~8.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子 3）适用：极弱酸碱物质 pH=3~7弱酸；pH=7~8弱碱；两性化合物 2）正相键合相色谱 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流动相：水，通过盐浓度或PH控制组分保留值 四、排阻色谱色谱 （size- exclusion chromatography） 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原 理：按分子大小分离。