基因工程4-目的基因的分离和获得及重组基因的导入(中国药科大学生物工程所有课件)指导.ppt

第四节 基因的分离和获得 中国药科大学 生物制药教研室 目标基因克隆的三大战略： 1.利用PCR技术或化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达； 2.构建感兴趣的生物个体的基因组文库或cDNA文库； 3.利用基因差异表达获得目的基因。 基因的分离和获得的常用方法 一、基因分离的物理方法 二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法 三、cDNA文库的建立与基因的分离 四、基因组文库法 五、基因的化学合成 六、聚合酶链反应技术（PCR） 一、基因分离的物理方法 根据DNA分子的两条链存在着G≡C，A=T碱基配对。 如DNA分子中某段的G≡C碱基对含量高，则其热稳定性就高，其溶解温度（Tm）就高。这样，人们通过控制溶解温度使富A=T区解链变性，而富G≡C区仍维持双链。 当利用单链核酸酶S，酶去除解开的单链部分，得到富G≡C区的DNA片段 。 二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法 用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上与一般基因大小相当的DNA片段（1000bp），然后，将这些片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在受体菌（如：E.Coli）中进行扩增，再用适当的筛选方法筛选出你所要的基因。 优点：操作简单，命中率较高。 缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会漏。 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 1、随机酶切成基因相当大小的片段（约1000bp)； 2、重组入适当载体（质粒）； 3、转化进宿主菌（E.coli)，扩增； 4、筛选出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。 鸟枪法适用于原核细菌 目的基因的克隆分离 三、基因文库法 cDNA文库（cDNA library) 则是将某生物特定的组织器官或发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的产物。 基因组文库(Genomic library)是将某一生物基因组DNA全部克隆后获得的重组子群体的总称。 基因文库(Gene library)是通过克隆的方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。 构建基因文库的意义 1.通过基因文库的构建贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，保存物种遗传种质。 2.从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。 3.构建基因文库是研究基因本身的需要,如基因结构的分析、基因表达和调控的研究等。 基因组文库的类型: 质粒文库、噬菌体载体文库、粘粒文库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库。 几个物种基因组大小及基因数目 构建基因组文库应满足的条件 基因组文库的完备性：是从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率。 基因组文库的大小: 1）基因组的大小； ????????? 2）克隆片断的长度； ????????? 3）从中分离特定基因的置信度。 N=1n(1一P)／ln[1-L/G] 式中P为期望概率，L为单个重组体的DNA片段的长度，G为基因组DNA的总长度。N是所需要的重组体数目 例如，某一哺乳动物基因组G=3x109bp，以17kb的随机片段克隆构建的文库中，使任一给定DNA序列达99％的概率出现，则： N＝ln(1-0.99)／ln[1一(17x103／3x109)=8.1x105 ????? 如果克隆片断长为20kb，则N=6.5X105 果蝇的基因组约1.5X108bp，以20kb克隆时，N=4X105 基因组文库的构建 ?? (一）基因组DNA的分离制备 原核细胞的基因组包括其拟核的DNA和附加的遗传体系如质粒DNA，真核细胞的基因组包括其核基因组及细胞器如线粒体和叶绿体的DNA。 质量必须满足：1. 结构具有相对完整性；2. 尽量排除其它大分子成分的污染(蛋白质、多糖及RNA等)；3. 保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及离子等。 （二）基因组DNA的片段化 1.限制性内切酶对DNA分子的酶解 两种方式：DNA完全酶解和DNA不完全酶解。 DNA完全酶解 人基因组DNA酶解琼脂糖凝胶 M：DNA分子marker；1：未酶解的人基因组DNA；2：Rsa I完全酶解后的DNA M 1 2 DNA不完全酶解 人基因组DNA以Sau3A酶进行的不完全酶解 M：DNA分子marker；1：未酶解的基因组DNA；2-10：显示酶解的程度逐步提高 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 用DNA的随机片断克隆法来：机械剪切和部分酶切 1)??随