斑马鱼胚胎整体原位杂交_622.docVIP

斑马鱼胚胎整体原位杂交 (Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos) 北京大学遗传与发育生物学实验室 整理者：肖安 版本：V6.22 Build 2006-8-17 说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。 在整个实验中应当注意： (1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。 (2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。避免漏加溶液。 (3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。 (4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。吸时动作要轻。任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。 (5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。 第一天 以下操作需戴乳胶手套。 1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。 1.1 吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。 梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。稀释时间宁长勿短。 特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。 1.2 PBST处理5分钟，两次。 2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。 2.1 用蛋白酶K的PBST溶液(在管中原有的约1mLPBST中加入1uL10mg/mL的蛋白酶K，终浓度10ug/mL)常温消化，时间可参考下表： 胚胎时期 处理时间 尾牙期(tail bud stage)前 不处理 5体节(5 somites, 5s) 酌情处理 6s 30秒 16s 1分钟 18s, 24h 2分钟 48h(H2O2脱色) 4分钟 3d(H2O2脱色) 10分钟 48h(PTU处理) 30分钟 3d(PTU处理) 45分钟 5d(PTU处理) 1小时 消化的目的是使探针更容易进入组织中。应根据胚胎质量、以前原位杂交结果适当增减时间。注意双氧水脱色的胚胎受损害较大，蛋白酶K处理时间应大大短于培育时加入PTU阻止色素生长的胚胎。 理论上换新的酶和新胚胎都应该重试处理时间。 以下操作室温进行，注意溶液预热。 2.2 消化时间到后，先尽快用PBST暂时漂洗，然后PBST洗5分钟，一到两次。 在PBST洗后或下一步多聚甲醛固定后可以按照探针将胚胎分管和混合，注意同一管中的胚胎发育时期不宜相隔过近，以免最后观察结果时难以分辨。但若相隔过远，后面的染色时间可能会有很大差异，并且处于发育较早期的胚胎破裂时卵黄可能污染发育较晚期的胚胎。 每一时期每一探针需15枚左右(发育早期的胚胎在实验中容易损坏，宜多取一些)。 若做正负对照，正对照用已明确的Marker基因探针(反义RNA链)，或者对胚胎进行双染。负对照使用正义RNA链，或者不加探针(如粗略筛选时)。注意及时写上新的标签编号并记录下每个编号对应的各胚胎时期。 2.3 4%多聚甲醛(paraformaldehyde, para)固定20分钟。 提前解冻，每次实验都尽量用一管新的多聚甲醛，避免RNase污染。未使用完部分可用于固定胚胎。 用于原位杂交的胚胎都使用多聚甲醛固定。甲醛苦味酸混合液固定胚胎虽然能更好的保持形态，但将破坏胚胎抗原性，导致零结果。 2.4 PBST洗5分钟，两次。 以上两步用PBST洗涤也可改为PBT，后者含有小牛血清，对胚胎保护更好。 以下65℃的操作步骤在水浴箱(water bath)或杂交炉(hybridization oven)中进行，注意溶液预热。 3 预杂交(Prehybridization)。 加入500uL HYB，65℃预杂交至少4小时。 4 杂交(Hybridization)。 4.1 RNA探针(RNA probe)以3ng/uL浓度溶于HYB，72℃温育5分钟，再冰上放置以破坏形成的可能妨碍杂交的二级结构。 4.2 吸去胚胎管中的HY