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Western blot基础知识 一、 原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 根据凝胶电泳的类型，WB可分为： *还原（变性）WB：最常用的一类，使用SDS电泳。主要是来检测蛋白质的特性、存在与否、蛋白质的同源性以及估计蛋白质的分子量等 *非还原（非变性）WB：主要用来分析蛋白质的结构、保持蛋白的活性的。一般不使用SDS、DTT等变性剂。 western显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 三、主要试剂 1、29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液 丙稀酰胺 29g N，N’-亚甲叉双丙稀酰胺 1g 温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水 至100ml终体积 储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、 十二烷基硫酸钠SDS溶液10%(w/v) SDS 0.1g 去离子水 1ml 室温保存。 3、 分离胶缓冲液1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8) Tris base 18.15g 1mol/LHCL 48ml SW 至100ml终体积 过滤后4℃保存。 4、 浓缩胶缓冲液0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8) Tris base 6.05g SW 40ml 用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后4℃保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。 5、 TEMED原溶液 N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6、 SDS加样缓冲液pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml， 甘油 6.4ml 10%SDS 12.8ml 巯基乙醇 3.2ml 0.05%溴酚蓝 1.6ml H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。 7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 Tris 30.3g 甘氨酸 188g SDS 10g SW 至1000ml 得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。 8、 转移缓冲液 甘氨酸 2.9g Tris碱 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml SW 至总量1L 9、 丽春红染液储存液 丽春红S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g SW 至100ml 加水用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。 10、 脱脂奶粉5%(w/v)。 11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。 12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。 13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。 14、 过氧化物酶标记的第二抗体。 15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。 16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。 17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。 18、 100mmol/L NaCl。 19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。 四、实验流程 第1步：组织或细胞蛋白提取 蛋白提取的质量直接决定着W