生物医学和环境科学 2003年16卷03期 267 - 副本（副本）.docVIP

生物医学和环境科学 2003年16卷03期 267~275页 怀牛膝多糖和枸杞多糖在右旋半乳糖诱导小鼠衰老模型中非酶转化的抑制作用 邓宏斌，崔大鹏，蒋建明，冯艳春，蔡年生，李殿东 药用生物技术研究所，中国医学科学院和北京协和医学院 北京 10050，中国 目的：探讨怀牛膝多糖（ABP）和枸杞多糖（LBP）在右旋半乳糖诱导小鼠衰老模型中非酶转化的抑制作用和机理。方法：血清年龄水平是由年龄-酶联免疫吸附，MTT法来确定，它们通常用于确定淋巴细胞增殖，IL-2活动由一种生物测定方法决定。自发活动被用于检测老鼠的神经肌肉活动，延迟的单步调试的方法被用来检查小鼠的学习和记忆能力，比色测定法被用来测定小鼠皮肤中羟脯氨酸的浓度，邻苯三酚自氧化法用来确定红细胞的超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果：在小鼠体内注入ABP或LBP后，我们发现小鼠体内血清年龄水平降低，羟脯氨酸在小鼠皮肤中的含量降低和自发运动活动在右旋半乳糖小鼠衰老模型被检测到，同时淋巴细胞增殖和IL-2活动、学习和记忆能力、红细胞的SOD活性都增强了。结论：ABP和LBP能抑制右旋半乳糖诱导小鼠衰老模型中小鼠体内非酶转化，ABP比LBP有更好的抑制作用。 关键字：怀牛膝多糖（ABP）；枸杞多糖（LBP）；右旋乳糖；非酶转化；老化 介绍 我们之前的工作表明，给小鼠注射右旋半乳糖可以诱导类似加速老化的变化。老化模型显示，神经损伤会减少抗氧化酶活动，而产生轻微的免疫反应，ABP是一种从中国草药牛膝的根中提取的活性成分。布鲁姆的研究表明，ABP能够加强免疫系统的免疫能力，抑制肿瘤细胞转移，增加白细胞的数量，从而保护了肝细胞。枸杞多糖（LBP）是一种从枸杞中提取的生物活性物质，它可以提升T，B，CTL，NK和MФ β细胞因子增强受肿瘤痛苦的小鼠和辐照受损小鼠的功能免疫，调节NIM网络，本研究的目的在于调查ABP和LBP在右旋半乳糖诱导小鼠衰老模型中的效果，包括神经活动，血清年龄水平，皮肤羟脯氨酸浓度和自发运动活动，淋巴细胞核扩散和IL-2活动，学习和记忆能力，红细胞SOD活性。 材料和方法 受试物 怀牛膝多糖（ABP）和枸杞多糖（LBP）由袁天根教授，上海有机化学研究所，中国科学院提供。药物应该放在含有PBS和滤过0.22um膜的生理盐水。 动物与治疗 选用三个月大的雌性小鼠C57BL/6J（总共32只，18g~22g重，由中国科学院实验动物中心提供，CAMS），并随机分为4组，每组8只小鼠。一周适应期后，小鼠们将会进行下列一系列的一个8周的日常治疗：1、给第一组的小鼠每只注射0.4ml PBS作为媒介物控制；2、给第二组小鼠每只按50mg/kg注射右旋半乳糖；3、给第三组小鼠每只按50mg/kg右旋半乳糖+100mg/kg ABP；4、给第四组小鼠按50mg/kg右旋半乳糖+100mg/kg LBP。8周以后，4组小鼠将会被杀死，并及时将它们的血清，器官和组织收集起来，为后面实验做准备，将它们存储在-70℃温度下。 年龄酶联免疫吸附测定 年龄的定量测定将会由年龄酶联免疫吸附法来测定。简单地说，在96孔板上涂一层3ug/ml AGE-BSA，每孔100ul，放在4℃涂料缓冲液中过夜。孔板用150ul洗涤液（PBS，0.05％％℃下2小时。经过洗涤后，50ul的1:10稀释血清（样本）。添加稀释缓冲液（PBS，0.02％％℃下孵化1小时。孔板要像上述那样子清洗6次，添加100ul的对硝基苯磷酸液到每一个孔板上。然后在30~60分钟培养后，在光学密度（OD）405nm下同酶联免疫吸附试验（ELISA）显微镜下观察读数（3550，Bio-Rad）。AEG-BSA被用来作为一种竞争抗原来生成一个标准。样品的年龄值将由标准曲线来计算。 淋巴细胞的增值诱导淋巴细胞增殖实验 淋巴细胞增殖将会进行一些描述性可接受的改变。动物死后在无菌条件摘除脾脏，细胞悬浮液的摩擦对无菌不锈钢组织钢丝网(100um)在10毫升磷酸盐缓冲液中。污染细胞溶解的红细胞是治疗细胞球放在5毫升三羟甲基氨基甲烷-氨基盐氯溶解缓冲液（0.1 8摩尔/升 氯化铵在0.1 7摩尔/升 三羟甲基氨基甲烷 pH值7.2)在室温下放置2分钟。然后用磷酸缓冲液清洗，脾淋巴细胞是放在100 uL无血清细胞冻存培养基(RPMI) 1640介质中在10 6细胞/孔板 有或没有7 ug /毫升伴刀豆球蛋白（ConA）。孔板在37℃下孵化44小时后,，20 uL氯丁胶新型交联剂（MTT）(5毫克/毫升)添加到每个孔板和培养基中，在37℃培养6小时。读数在显微感光版阅读器(型号3550,生物阅读)在波长570 nm处。增殖的淋巴细胞被表示为刺激指数(外直径OD在570nm的测试样品/ OD的570nm非刺激控制淋巴细胞)。 IL-2测定 IL