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生物化学实验报告姓 名： 范嘉俊学 号： 3140070081专业年级： 2014级中西医临床五年制组 别：第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称(Title of Experimetn)肝糖原的提取、鉴定与定量实验日期(Date of Experiment)2016-01-07实验地点(Lab No.)第四实验室合作者(Partner)刘海指导老师(Instructor)殷志新总分(Total Score)教师签名(Signature)批改日期(Date)1.实验原理（1）肝糖原提取与鉴定①提取：1.糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，释放出糖原。2. 5%三氯醋酸溶液能使用糖原与蛋白质分离，糖原保存于上清液，而蛋白质沉淀。3.糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。②鉴定：糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。糖原还可被酸水解为葡萄糖。利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。（2）肝糖原定量测定糖原在浓酸中可水解成为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糖醛衍生物—5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在(10~100)mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量标准溶液比色，通过标准对照法（直接比较法）即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其它成分，而保留肝糖原。2.实验材料（1）实验样品：鸡肝。（2）主要试剂：肝糖原的提取与鉴定：95%乙醇，0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液，0.15mol/LNaCl溶液，浓盐酸，NaOH溶液，碘试剂。肝糖原定量测定：30%KOH溶液，0.5mg/ml的葡萄糖溶液，蒸馏水，蒽酮显色剂。（3）主要仪器与器材：可见光分光光度计，恒温水浴箱，试管架，三支支试管，加样枪，加样枪架，普通离心机，研钵，刻度吸量管，白瓷反应器，100ml容量瓶。3.实验步骤（1）实验流程①肝糖原的提取与鉴定注意事项：①在提取肝糖原中，向上清液中加入乙醇后，要充分混匀（可以用玻璃棒搅拌）。②糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基的多少有关。肝糖原分支中葡萄糖残基在20个以下，吸附碘后呈现红棕色。③糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。②肝糖原的定量测定步骤操作糖原提取在试管中加入30%KOH1.5ml，在称取0.10～0.15g肝组织放入试管中，置沸水浴中15min。取出后冷却，将管内容物全部移入100ml容量瓶，定容，摇匀。糖原的测定取3支试管，按下表操作：试剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏水1.0--标准葡萄糖溶液-1.0-糖原提取液--1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5混匀，沸水浴10min，冷却。在分光光度计620nm波长处，用空白光溶液调零，测定个溶液的吸光光度（A）。计算出样品肝糖原含量。注意事项：①肝组织必须在沸水浴中完全溶解，否则影响比色。②注意要全部溶液，用水多次洗试管，一并收入容量瓶中。③蒽酮溶液必须2倍于被测液。④若肝糖原含量小于1%，须改用间接测量法，即肝组织消化后，用95%乙醇沉淀糖原。4.实验记录实验中观察到的现象（1）糖原的提取与鉴定①鸡肝上清液经乙醇处理，离心后得到微量的白色沉淀物。沉淀上清液②糖原溶解液滴加碘液后，对比纯碘液，有红棕色物质生成。纯碘液红棕色物质③用班氏试剂与糖原水解液反应，混匀后沸水浴2min，发现管壁有砖红色沉淀。反应前 反应后（2）肝糖原定量测定加蒽酮试剂的糖原溶液（水浴后）：样品管标准管空白管可见：空白管中为浅黄色；标准管中为蓝绿色；样品管中为浅绿色。3.原始实验数据：620nm波长吸光值记录表测定次数各管吸光值（A620）空白管标准管样品管100.6540.098200.6540.098300.6530.098各管平均值62000.65370.0985.结果与讨论：1.结果①由碘液反应结果可知，鸡肝中存在少含量的肝糖原。②肝糖原含量计算：根据如下公式：肝糖原（g/100g肝组织）=A样本 /A标准 0.05(100/肝组织重)0.11.11计算得本组肝糖原含量为0.554g/100g肝组织。2.讨论（1）肝糖原的提取与鉴定实验：第二次离心后的糖原溶液白色沉淀明显；加碘试剂与糖原试剂混合有红棕色沉淀，鉴定出糖原；实验结果与预期基本吻合，实验基本成功（2）肝糖原的定量测定实验：通常，每百克鸡肝组织中肝糖原含量在2-3克之间。本实验中测得肝糖原数值（0.554g/100g肝组织，即0.554%）偏低于标