琼脂糖电泳.doc

实验项目五、DNA的琼脂糖凝胶电泳 姓 名： 赵家熙 指导教师： 汪财生 实验室： 6503 组员：① 章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 电泳图谱（编辑、打印、粘贴） 二、绘制DNA分子迁移速率与DNA分子大小对数线性方程，报告待测DNA片段大小（bp）、分析电泳图谱 本实验使用%1agarose。 迁移速率 0.783 0.683 0.616 0.516 0.466 0.35 0.1 lgbp 2.397 3 3.397 3.698 3.875 4 4.176 y = -2.4787x + 4.7504 所以lgbp=-2.4787*0.116+4.7504 =4.462 所以待测DNAbp=28973 第四部分：课后研讨题 1、总结本实验操作的关键环节和注意事项。 1.制胶时，应注意胶有无气泡。在拔梳子前要先加TBE Buffer在梳齿旁。 2.点样时要小心。不要洒出。加一定量的样品。 3. 取出电泳后的胶，小心推至溴乙锭染色液中，溴化乙锭是DNA诱变剂和致癌物质。要小心。 4.在拿胶的时候应注意不能将胶弄破。 2、实验所用DNA染料EB具有潜在的致癌性，查阅资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。 sybr green 和 gelred 这两个的优点都是低毒性，而且稳定性很高，但是sybr green 的灵敏度不如EB，且背景荧光很强，但普通的核酸检测都能做到； gelred 是目前市场上最好的核酸染料，无毒，而且耐热，无背景荧光，但是加入量多容易引起拖带，价格也贵。1、DNA的分子大小及构型线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。2、琼脂糖浓度、电源电压在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，不同分子量的DNA段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。5、嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。6、离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。DNA的制备。?适合分离大片段DNA。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。在青贮饲料总DNA的提取实验中，是通过琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收来实现的。所提取的DNA纯度较高，可直接用于下游分子操作，提取方法灵敏度高，能全面反映样品中的微生物原貌可提取大分子DNA。在“洋葱帕克霍尔德氏菌HMW·DNA的制备及酶切研究”的实验中提到，构建大片段基因组文库的关键就是获得高分子量的基因组DNA。而利用成熟的商品化试剂盒提取基因组DNA只能得到大小约在20kb左右的DNA；酶抽提法需经过多次抽提法才能得到较纯的DNA，但极易造成基因组断裂，也难以得到大于300kb的基因组DNA。两种方法均不能达到目的，但经