研究生细胞生物学实验.docxVIP

一、原代细胞培养及活力鉴定：内容：1.小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养2.活力鉴定采用台盼蓝染色并计数的方法。实验所需（每组）：小鼠孕鼠1只，75%酒精1瓶，大烧杯一个，饭盒1个（内有：大剪刀2把，大镊子2个，眼科剪刀2把，眼科镊子2把），一次性培养皿4个，D-hank’s液（含双抗）50ml，0.25%胰酶10ml，DMEM培养基（含10%血清）20ml，50ml离心管2个，T25培养瓶1个，移液器一套（1000ul、200ul、10ul），灭菌Tip头一套（1000ul、200ul、10ul），0.4%台盼蓝0.1ml，血细胞计数板1个，计数板专用盖玻片2个，燃烧酒精0.2L。实验方法： 1、高压消毒取材用器材：剪刀（包括眼科剪）数把、镊子（包括眼科镊子）数把。2、断颈处死孕第13天的孕鼠，无菌条件下取出条状子宫，放入含有PBS液的平皿内。3、分离每一个胚胎，祛除表面胎膜，在D’hanks液内漂洗后转入另一个新的放有PBS液的平皿内。4、祛除头、四肢、尾巴和内脏，清洗体壁，尽可能祛除血细胞，然后，用剪刀剪碎体壁成1mm3的小块，加入trypsin(大约每个胚胎 1-2ml)， 室温或37°C 消化15min，每5分钟轻轻晃动一次。待上清浑浊，组织块消化到很小时，吸取上清到50ml离心管内，用血清终止消化。然后，离心，1500rpm离心10分钟。弃上清，将沉淀洗涤2遍，待接种。5、制备MEF培养基：高糖DMEM，10% (v/v) FCS，1/100 (v/v)青链霉素。6、将上述制备好的细胞种植于T25培养瓶，用MEF培养基培养，种植密度为1x105/ml。将培养瓶放于370C，5%CO2孵箱进行培养，此即为0代。每日观察，隔天换液。待细胞呈80-90%汇合时，进行消化传代。 二、细胞的浸润与转移：内容：1.划痕实验2.transwell实验实验所需（每组）：贴壁培养在24孔板中的肿瘤细胞，细胞浸润实验24孔板专用的transwell（孔径6-8um、单个装）个，灭菌0.1%明胶1ml，24孔板1个，PBS液（含双抗）50ml，0.25%胰酶10ml，肿瘤细胞培养基20ml，血清3ml，15ml离心管2个，移液器一套（1000ul、200ul、10ul），灭菌Tip头一套（1000ul、200ul、10ul），燃烧酒精0.2L，棉棒1包，结晶紫染液1ml。实验方法：1.划痕实验用无菌200ul tip头在培养有肿瘤细胞的24孔板中轻轻划一道直线（划掉细胞为准），更换无血清培养基，培养24小时后观察。2. transwell实验1）提前将transwell用0.1%明胶包被。2）将具有侵袭能力的肿瘤细胞胰酶消化，无血清培养液重悬。3）24孔板每孔下室中加入含10% 血清（作为趋化剂）的培养液；上室中立即加入无血清培养液重悬的细胞悬液。4）将24孔板放入培养箱中常规培养。24小时后以无菌棉棒轻轻揩去上室残留细胞后，用4%的多聚甲醛固定上室底面的细胞，室温放置10min。蒸馏水洗涤。5）蒸馏水洗去固定液后，结晶紫染色10 min。蒸馏水冲洗后观察拍照。三、细胞转染内容：miRNA的细胞转染实验所需（每组）：联系好荧光显微镜。荧光标记的miRNA、脂质体2000、贴壁培养在24孔板中的肿瘤细胞，灭菌1.5ml EP管，D-hank’s液（含双抗）50ml，无血清无抗生素转染专用Opti-MEM 培养液5ml，移液器一套（1000ul、200ul、10ul），灭菌Tip头一套（1000ul、200ul、10ul），燃烧酒精0.2L。实验方法：1.用无血清无抗生素转染专用Opti-MEM 培养液分别稀释适当体积的待转染的miRNA和转染试剂（脂质体2000）。轻轻混匀后室温孵育5min。2. 将脂质体2000稀释液缓慢逐滴加入待转染的miRNAs稀释液中，轻轻混匀。混合液室温孵育20min。3.从培养箱取出待转染细胞，吸弃培养液，用D-Hank`s液洗一遍。吸净洗液后每孔加入无血清无双抗转染专用Opti-MEM 培养液。4.将孵育好的miRNA-脂质体2000复合液缓慢逐滴加入24孔板相应孔中，做好标记，轻摇混匀后放培养箱继续培养。5. 转染6h后，吸弃转染工作液，用D-Hank`s液洗去未转入的miRNA-脂质体2000复合物，更换相应培养液，荧光显微镜观察。四、细胞凋亡内容：Annexin V/PI 双染流式检测肿瘤细胞的凋亡。实验所需（每组）：联系好流式细胞仪。Annexin V/PI 双染试剂盒，贴壁培养在24孔板中的肿瘤细胞，双氧水，灭菌1.5ml EP管，PBS液50ml，0.25%胰酶10ml，血清3ml，15ml离心管2个，移液器一套（1000ul、200ul、10ul），灭菌Tip头一套（1000ul、200ul、10u