遗传工程的载体课件.pptVIP

遗传工程的载体 随着人们对遗传物质DNA的深入研究，许多科学家尝试直接用DNA转化原核或真核生物但成效甚微，理想重组体分子的发生频率极低。 主要的原因是：外源DNA在宿主细胞连续增殖的情况下，由于不能自我复制而丢失，只有少数被整合到质粒或寄主基因上的片段才能幸存下来。 DNA能在寄主细胞中得到复制的一个必要条件就是具备复制起点。细菌和病毒的基因组通常只有一个复制起点。 这种能够自我复制，而且仅具有一个复制起点的DNA分子称为复制子( replicon )。 大多数DNA片段不是复制子，因而不能自我复制；DNA分子即使包含复制起点，在外源寄主细胞中也不一定有功能。 DNA重组技术的优越性在于利用寄主细胞中有复制功能的复制子作载体，连上理想的外源DNA片段，然后被送到寄主细胞中。 载体的功能及特征 通常把能携带外源基因进入受体细胞的运载工具称为基因克隆载体。 载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 载体应具备的条件： 质粒载体 质粒（plasmid)是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，也成CCC-DNA。 质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的；质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒的复制 质粒是一个独立的复制单元（复制子），带有复制起始点及其相关的复制元件。 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制； 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。 质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制-质粒DNA复制启动控制 RNAI折叠成三叶草结构，它与RNAII前提结合使后者不能形成特定的二级结构，从而影响了RNAII与DNA形成稳定的杂种分子，是质粒DNA的复制不能正常进行。 在细胞中RNAI的半衰期很短，它的浓度是由自由基的剂量（也就是质粒的拷贝数）决定的。 如果细胞中的拷贝数高于正常水平， RNAI的含量上升，从而抑制了质粒的DNA的复制。相反，如果细胞中的质粒拷贝数低于正常的水平， RNAI的含量下降，从而促进了质粒DNA的复制。 这就是RNAI控制细胞中质粒的拷贝数的方式。 所以根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid 松弛型质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid 一般来说，构建克隆载体是松弛型质粒。 质粒的不相容性（不亲和性） 当两个质粒带有相同的复制起始位点时，它们在复制和向子细胞的分配中就会产生竞争，如果没有选择，这两个质粒就不能在同一个细胞共存，这种现象被称作质粒的不相容性（incompatibility of plasmid)或质粒的不亲和性（plasmid incompatibility) 。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势 质粒的改造 天然质粒是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外构建改造的的质粒，往往不能满足分子克隆对载体的需要，只有按预定目标人工构建的质粒才能成为优良的载体。 构建一种质粒载体需要考虑以下几个方面： 1.质粒载体的分子量（单位bp）应尽可能小。 分子量小的质粒作载体有很多有点：如容易从寄主细胞中提取；较能抵抗机械（超声波）切割带来的危害；便于限制性内切酶的酶切和连接等。 2.应该了解载体上基因位置、限制性内切酶的作用位点。 如果有可能的话，最好还要了解核苷酸序列。 3.在理想寄主中，载体应该容易繁殖，拷贝数多；这样可以得到大量载体和DNA重组分子。 4.载体应该包含一个或两个可供选择的标记性状（基因），从而可以区别含有载体的转化细胞和不含有载体的非转化细胞。 5.在载体上有多克隆位点，便于质粒的酶切和外源DNA片段的克隆。 常用的遗传标记基因