相关实验操作专题CCK原理优势步骤.docVIP

检测原理：? ◆ Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。 ◆ WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。 ◆ CCK法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。 CCK方法的优势：? ◆ 表1 CCK法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较 检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK法甲臜产物的水溶性差（需加有机溶剂溶解再检测）好好好产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高检测时间较长较短较短最短检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm细胞毒性高，细胞形态完全消失很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷◆ 酚红和血清对CCK法的检测不会造成干扰； ◆ 细胞毒性非常低，因此加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。关于不同细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒的比较和选择关于不同细胞增殖和细胞毒性检测试剂盒的比较和选择，请参考 CCK法的操作步骤（更多内容请见说明书）： 实验一：细胞活性检测 1、在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃,5% CO2）。 2、向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值??读数）。 3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。 5、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。 实验二：细胞增殖-毒性检测 1、在96孔板中配置100μL的细胞悬液（约5000个细胞）。然后在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。 2、向培养板加入10μL不同浓度的待测物质（如：DDP）。 3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。 4、向每孔加入10μL CCK溶液（试剂盒中已经配置好，注意不要生成气泡-会影响OD值的读数）。 5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。 6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。 7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 活力计算： 细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100A（加药）：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度A（空白）：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度A（0加药）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 保存条件： 4℃避光保存一年有效，-20℃避光保存两年有效。