生物与分子生物学复习 第41章 基因工程及蛋白质工程15.pdfVIP

1第41章 基因工程及蛋白质工程 Chapter 41 Gene and Protein Engineering 2第一节 概 述 基因工程(Gene Engineering): 是对携带遗传信息的分 子进行施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表 达。基因工程这个术语既可用来表示特定的基因施工 项目，也可泛指它所涉及的技术体系，其核心是构建 重组体DNA的技术，因此基因工程和重组体DNA技术 (DNA recombination)有时也就成为同义词。 蛋白质工程(Protein Engineering): 是在基因工程基础 上发展起来的。是指通过对蛋白质已知结构与功能的 认识，借助计算机辅助设计，利用基因定位诱变等技 术改造蛋白质，以达到改进其某些性能的目的。 3? 1972年美国斯坦福大学的Berg和他的同事将λ噬 菌体基因和大肠杆菌乳糖操纵子插入猴病毒SV40 DNA中，首次构建出DNA的重组体。 ?1973年Cohen同时与S.Boyer合作，将非洲爪蟾含核 糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆 菌，转录出相应的mRNA。 此研究成果标志基因工程的正式问世；并说明 了质粒分子可以作为基因克隆的载体能携带外源基因 导入宿主细胞，也说明了真核生物的基因可以转移到 原核生物细胞中并在其中实现功能表达。 41. 基因工程的准备阶段 (1) 理论基础: ? 在40-50年代确定了遗传信息的携带者，即基因的 分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的 物质基础问题。 ? 在50年代揭示了DNA分子的双螺旋模型和半保留复 制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。 ? 在50年代末期和60年代，相继提出了“中心法则”和 操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，从而阐明 了信息的流向和表达调控问题。 5(2) 技术基础: ? 20世纪60年代末70年代初，限制性内切酶和DNA连接酶等的 发现，使DNA分子进行体外切割和连接成为可能。 ? 在60年代还发展出了琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交 技术，这对于DNA片断的分离、检测十分有用，并很快被应 用于基因操作实验。 ? 70年代中期，DNA分子的核苷酸序列分析技术问世。 以上这些技术，使DNA的结构分析问题得到了根本的解决。 ? 1972年首次构建了一个重组DNA分子，1973年将外源基因与 载体连接，得到了基因的分子克隆，并提出了体外重组的 DNA分子进入宿主细胞的过程，以及在其中进行复制和有效 表达等问题。 ? 80年代PCR技术的发明使基因体外扩增发生了革命性变化。 6第二节 工具酶 DNA分子的剪切、重组、合成及修饰涉及 一系列酶促反应，催化这些反应的酶是基因操 作的基本工具，故又称为工具酶。工具酶在基 因克隆中占有非常重要的地位，只有了解其作 用机制后，才能加以灵活应用。 7用于核酸操作的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶 反转录酶 8一、限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)又 称限制性内切酶，简称为限制酶。这类酶能识别双 链DNA分子内部的特异位点并且裂解磷酸二酯链。 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA 的入侵。1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d 株中分离出Hind II和Hind III 。 9（一)限制酶的命名和分类 1. 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 Haemophilus influenzae d （嗜血流感杆菌d株） H i n d II H i n d III 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 10 2. 限制性核酸内切酶的分类 主要特性 I 型 II 型 III 型 蛋白结构 限制修饰 辅助因子 识别序列 切割位点 双功能 异源三聚体 ATP Mg2+ SAM TGAN8TGCT(Eco B) AACN6GTGC(Eco C) 距识别序列1kb处 随机性切割 单功能 同源二聚体 Mg2+ 旋转对称序列 识别序列内或附近 特异性切割 双功能 异源二聚体 ATP Mg2+ SAM GAGCC CAGCAG 距识别序列下游 24-26 bp处 （二) II型限制酶的识别和切割位点 II 型限制性核酸内切酶的基本特性: 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部 分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序 列呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome). EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’ 5‘ … G C T G