免疫透射比浊法分解.doc

免疫透射比浊法 一、原理 当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法。这一方法早于1959年Schultre和Schuick等报道应用于血浆蛋白与其抗体结合后形成复合物，导致浊度的改变，再进行透射比浊测定，一般采用抗体对抗原定量的透射比浊法，称为免疫透射比浊法。其原理是，利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少对抗原或抗体进行定量的方法。在介质溶液中，抗原与特异性抗体在一定条件下才能形成复合物，一定的条件包括：①对抗体的要求，作为体液或组织中蛋白质种类很多，若要快速特异检测，要求有单价特异抗体才能与抗原形成复合物。某一种蛋白质，有其特异抗体才能与该抗原结合，形成免疫复合物进行定量，若抗体不纯混杂有另一种或两种少量的抗体，这种免疫复合物就不是单一复合物而是大杂烩，结果偏高；②抗原抗体比例适当，因免疫复合物形成有三个阶段，第一阶段是复合物形成抗原抗体复合物；第二阶段是初步形成抗原抗体复合物，此阶段是复合物交联成大的网格状结构；第三阶段是复合物聚合产生絮状沉淀。只有在抗原与抗体等价时即无过剩抗体，此时，复合物的结合与解离处于平衡状态，其混浊程度达高峰。在抗体过量时，随抗原量的增加而复合物形成也增加，其测定只能在反应曲线的左侧进行（见图18-4）；③一般要求溶液中有非离子性亲水多聚体促进免疫复合物的形成，如聚二乙醇6000等。溶液pH为6.5～8.0之间为宜。载脂蛋白有形成两性螺旋片（amphipathic helix）的特性，对脂质（特别是磷脂）有高度亲和力，与脂质结合后有时会掩盖抗原位点或构象改变，可以部分或完全丧失对抗血清的特异反应。为此，载脂蛋白检测过程中有必要先暴露抗原位点，所用试剂有表面活性剂，尿素，盐酸胍和吐温等解离蛋白剂，或用四甲基脲脱脂或有机溶剂脱脂等暴露抗原决定簇等方法，血清脂蛋白颗粒中的载脂蛋白，能在短时间内形成抗原抗体复合物进行定量；④抗原不能过量，因为抗原过量，抗原抗体复合物形成不但不增加，反而会减少，光散射或光吸收减少，检测结果反而偏低。  图18-4 抗原抗体反应曲线 在免疫比浊过程中，由于抗原抗体结合的三过程，从而导致光密度与浓度之间不呈线性关系，一般是3次方程曲线关系。若将抗原与抗体两个变量之间的变动特征恰当地反映出来，需要经过3次方程拟合成近似直线化的曲线方程，再进行运算，免疫比浊中，采用终点法或速率法，用5个或7个不同梯度进行定标，经3次曲线方程求出一条能反映真实情况的浓度与光密度的关系曲线方程，才能作为定量的工作曲线。 二、血清ApoAⅠ（B100）透射比浊测定法 脂蛋白抗原在溶液中与相应特异抗体形成抗原抗体复合物的混浊颗粒，分散于溶液介质中，在一定波长下测定其混浊程度，进行ApoAⅠ（B100）的定量测定。 （一）手工操作 1．原理 血清ApoAⅠ（B100）+抗人ApoAⅠ（B100）→抗原抗体复合物→测定光密度 2．试剂（伊利康） （1）Apo缓冲液（RⅠ），含4%PEG6000和表面活性剂 （2）羊抗人ApoAⅠ（B100）抗体液（RⅡ）：监用前取抗血清200μl，加0.9%NaCl液700μl，混匀，待用，置冰箱一周内有效。 （3）ApoAⅠ（B100）参考血清（RⅢ） 3．操作 （1）按ApoAⅠ抗血清液或ApoB100抗血清100μl，加相应的Apo缓冲液0.9ml的比例混合成单一试剂（Apo抗体液）。最好临用前配制当天用量。 （2）各试剂用量如下表 ??? ApoAⅠ??? ApoB100 标准管 测定管 空白管 标准管 测定管 空白管 参考血清 5μl 　 5μl 　 待测血清 5μl 　 5μl 　 ApoAⅠ抗体液 1.0ml 1.0ml 1.0ml 　 ApoB100抗体液 1.0ml 1.0ml 1.0ml 混匀各管，37℃保温10min，波长340min，于半自动分析仪上先吸入空白管液，再吸入标准管，仪器根据光密度及参考值得出一换算系数，再吸入测定管，仪器内根据光密度及系数进行运算，打印结果。 （3）定标方法，根据免疫比浊法原理，应取多点（3～9点），按y=a+bx+cx2+dx3的3次方程回归曲线进行定标，制作参考工作曲线。 ①校正工作曲线的绘制： 配制抗血清稀释工作液：按RⅠ试剂0.9ml，加RⅡ试剂100μl的比例（Apo抗体液）混匀，待用。 制备5点校正液：取RⅢ（参考血清），用0.9%生理盐水倍比稀释成5个浓度，第5管为原参考血清浓度，其他4管分别为第5管的1/2、1/4、1/8、1/16（或浓度为0即0.9%NaCl）。 表18-20 标准曲线制备的各管（点）浓度 管号 1 2 3 4 5 1号管（0）（μl） 5 　 2号管（1