代谢调控期总结.doc

前言： 1. 代谢调控发酵技术 利用遗传学或生物化学方法，人为在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量生成、积累的发酵 2. 代谢控制发酵的核心 解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常代谢调节，人为控制其代谢 3. 改变微生物遗传特性 选育组成型突变株（无需诱导物就能生产目的产物） ① 在诱导物为限制性基质的恒化器中筛选 ② 将菌株轮番在有、无诱导物的培养基中培养 ③ 使用诱导性能很差的基质 ④ 使用阻碍诱导作用的抑制剂 选育营养缺陷型突变株—解除反馈作用 获得中间产物，给予少量末端产物维持生长，但不足以引起抑制或阻遏反应 解除反馈作用的方法： ① 改变培养环境条件来限制末端代谢产物在细胞内部积累 ② 遗传上改造微生物，使其对末端代谢产物反馈调节作用不敏感 选育抗反馈调节突变株 ① 将经诱变处理过的野生菌型菌株涂布在含有末端代谢产物的结构类似物的琼脂平板上，培养一段时间后剩下不受末端代谢产物调节作用的突变株 ② 先除去对末端代谢产物反馈阻遏敏感的酶，使之成为营养缺陷型菌株，再对其诱变处理，使编码该酶的基因发生回复突变，但能与末端产物结合的调节位点不能发挥抑制酶活性的作用 选育耐分解代谢物阻遏突变株 ① 以一种能引起分解代谢物阻遏的基质作为唯一氮源，用含这种氮源的培养基的琼脂平板培养筛选经诱变的菌株 ② 轮番让菌株在含有和不含葡萄糖的培养基上生长 4. 改变代谢流 加速限速反应 通过生物合成中间体的分析，找到生物合成的速度限制步骤，外源合成该限速步骤的关键酶基因，并导入细胞内，提高目的产物产量 改变分叉代谢途径的流向 提高代谢分叉点的某一代谢途径酶系的活力，以得到高产的末端代谢产物 构建代谢旁路 用代谢工程方法还可阻断或降低合成副产物，特别是有毒产物 改变能量代谢途径 将血红蛋白基因导入大肠杆菌和链霉菌中，不仅在限氧条件下提高了宿主细胞的生长速率，而且促进了蛋白质和产物的合成 延伸或构建新的生物合成途径 引入外源基因延伸原代谢途径，产生新的末端代谢产物 第一章 微生物生长与调节 1. 微生物的生长形式 细菌——二等分分裂法 阳性：沿细胞上一次分裂周期中形成的中纬带开始；阴性：沿细胞长轴以居间并生的方式合成 酵母——出芽繁殖 两极性：母细胞在两端同一位置萌芽（子母不脱离会形成假菌丝） 多极性：母细胞每次萌芽出现在不同位置，如酿酒酵母 丝状微生物（霉菌，放线菌）—— 菌丝末梢伸长、分枝和交错成网，称为菌丝体，许多真菌能形成孢子，称分生孢子 菌丝生长的主要表现：菌丝伸长，菌丝体干重增加 影响菌丝长度的因素：遗传控制与生长环境（深层培养易受搅拌器的剪切作用） 调节菌丝球的疏密程度：使菌丝球变密实：过程添加易利用碳源（如葡萄糖），搅拌加快，供氧改善，反之用乳糖，搅拌缓慢，供氧跟不上 2. 微生物生长的测量 细胞数目的测定（优、缺点，适用范围P6 表1-1） 直接显微镜计数、平板活菌计数（稀释培养法）、自动细胞计数和分检法 细胞总量的测量 直接：细胞干重测量法（DCW）、比浊法、离心压缩细胞体积法（PCV） 间接：营养物质消耗的测定、测量产物的形成、发酵热、测定细胞组分 代谢产物：① 细胞组分在胞内浓度应相当一致 ② 在定量萃取与分析方面应当相当精确 ③ 非细胞固体中是否也含有同样的组分，细胞中此组分的含量与细胞量的关联 营养消耗： ① 细胞得率是否稳定（高低）② 养分测量方法准确性 ③ 是否存在干扰分析的物质，量有多少 Monod方程：　μ = μmS/(Ks+S)　　　　V = VmS/(K+S) 用以描述生长速率与基质浓度S间的关系，是经验公式，而米氏方程由理论推导得 Ks：营养物质的饱和系数，为μ=0.5μm时的营养物质浓度，衡量微生物对某种限制性营养物质亲和力的大小，Ks越小，说明微生物对该种营养物质的亲和力越大 Ks=100~300mg/L（被动扩散，异化扩散）；Ks=1~100mg/L（载体介入，主动运输） S：营养物质的浓度，能否用测定细胞组分法估算生长取决于： ① 非细胞性固体中是否含有此组分，如有就不能用此组分与细胞生长相关联 ② 细胞中该组分与细胞量间是否有定量关系、这种定量关系是否恒定 微生物生长与环境的关系 温度：菌在低于最适生长温度的温度范围内比在高温度范围内有更强适应力 一种对生长必需的酶的改变会使生长对热变性比野生型更敏感；温度降低细胞脂肪酸不饱和程度增加；随温度升高，死亡速率的增加远大于低活化能的生长速率的增加 与其细胞膜结构的物理化学特性有密切关系；与其细胞内某些关键酶的活性有密切关系 影响微生物比生长速率；影响生物合成的方向；温度影响碳源的基质得率 水活度：水对细胞的影响，Aw=ps/pw ps和pw分别为溶液和纯水在同一温度下的蒸汽压；Aw相当于相对湿