一株斜带石斑鱼_Epinepheluscoioides_病原菌的分离与鉴定讲义.pdfVIP

书第 36 卷第 6 期 福 建 水 产 Vol． 36 No． 6 2014 年 12 月 Journal of Fujian Fisheries Dec． 2014 收稿日期: 2014 － 10 － 28 基金项目: 福建省海洋与渔业厅项目“斜带石斑鱼苗种期病害防治技术研究”［闽海渔科 ( 2007) 004］． 作者简介: 林克冰 ( 1964 － ) ，女，硕士，副研究员，主要从事海洋生物病害防控技术研究． E － mail: kebingl@ sina. com 文章编号: 1006 － 5601( 2014) 06 － 0419 － 09 DOI: 10. 14012 / j. cnki. fjsc. 2014. 06. 001 一株斜带石斑鱼 ( Epinephelus coioides) 病原菌的分离与鉴定 林克冰，吴建绍，黄兆斌，葛 辉，朱志煌，孙敏秋 ( 福建省水产研究所，福建，厦门 361013) 摘要: 2011 年 7 月，福建省晋江某养殖场养殖的斜带石斑鱼 ( Epinephelus coioides) 发病， 病鱼体重 3 ～ 10 g，症状为鱼体色变深，拒食，离群缓慢游动，背鳍下方局部鳞片脱落、表 皮溃烂，肝脏点状发红。2011 年 7 月从濒死病鱼肝脏、肾脏中分离到 2 株细菌，分别命名 为 201107 － I 与 201107 － II，经生理、生化指标和 16S rＲNA 基因鉴定，这两株均为哈维氏 弧菌 ( Vibrio harveyi ) 。毒性实验发现这两株菌都能引起斜带石斑鱼表皮溃 烂 症，其 中 201107 － II 毒性较强，被用于后续感染实验。通过肌肉注射、腹腔注射与创伤浸浴 3 种方式 进行回归感染实验，得到 3 种方式对石斑鱼的半致死量 LD 50 分别为 4. 3 × 104、2. 9 × 105 和 5. 4 × 10 6 cfu /g 鱼体重。从人工感染的石斑鱼肾脏中再次分离到该菌，经生理、生化指标和 16S rＲNA 基因鉴定，为同株菌。药敏实验结果表明，该菌株对红霉素、大观霉素、氯霉素 等 16 种抗生素高度敏感，对呋喃唑酮、克拉霉素、环丙沙星等 9 种抗生素中度敏感，对苯 唑西林、青霉素 G、万古霉素等 13 种抗生素不敏感。本研究对石斑鱼病害防治与健康养殖 具有一定的指导意义。 关键词: 斜带石斑鱼; 哈维弧菌; 细菌鉴定; 药敏 中图分类号: S943 文献标识码: A 斜带石斑鱼 ( Epinephelus coioides ) 是福建 省海水养殖的重要经济种类。近年来，随着养殖 规模的扩大，在幼苗培育和成体养殖阶段，爆发 性死亡现象常有发生。细菌病是危害石斑鱼健康 养殖的常见病之一，特别是弧菌属种类 ( Vibri- o) ，常造成养殖石斑鱼的大量死亡，给水产养 殖业造成重大的经济损失［1 － 4］。 2011 年 07 月，福建省晋江某养殖场养殖的 斜带石斑鱼 ( E. coioides) 发病，症状为背鳍下 方局部鳞片脱落、表皮溃烂。为了确定该病病原 情况，本研究对病鱼的内脏组织进行病原菌的分 离培养，通过人工感染实验确定病原菌，并通过 常规的生理、生化特性和细菌 16S rＲNA 基因序 列的鉴定进一步确定了病原菌的种类。通过药敏 纸片法检测了该病原菌对常用水产药物的敏感 性，为预防发病提供理论支持。本研究对石斑鱼 病害防治与健康养殖具有一定的指导意义。 1 材料与方法 1. 1 患病石斑鱼的取样及表现症状 患病斜带石斑鱼 ( E. coioides) 于 2011 年 7 月取自福建省晋江某养殖场。病鱼体重 3 ～ 10 g， 福 建 水 产 第 36 卷 表现症状为鱼体色变深，拒食，离群缓慢游动， 背鳍下方局部鳞片脱落、表皮溃烂，肝脏点状发 红。 将患病石斑鱼置于充氧海水中，带回实验室 进行细菌分离。 1. 2 细菌分离 患病鱼体表用酒精棉球擦洗消毒后，用无菌 剪刀、镊子取肝脏和肾脏组织，涂布于 TCBS 平 板和 2216E 培养基平板，并放置在 28℃ 培养箱 中培养 24 h。长出菌落后再次在 2216E 平板上 划线做进一步纯化分离。纯化后的细菌用 15% 甘油，保存于 － 80℃冰箱中。 1. 3 石斑鱼的人工感染及半致死浓度 ( LD 50 ) 的测定 取体长 ( 6. 0 ± 0. 6) cm，体重 ( 4. 0 ± 1. 0) g 的健康斜带石斑鱼苗种进行人工感染实验。石 斑鱼分组饲养在 15 L 充气水桶中，水温 24℃， 盐度 27. 5‰，每天换水一次，早、晚各投喂配 合饲料一次。 将经过无菌生理盐水稀释配制成的 109 cfu / mL 浓度的菌液，以肌肉注射方式感染石斑鱼并 观察 2 d，用以评估分离得到的菌株