生物分子工程基础实验报告.doc

PAGE  PAGE 19 基礎生物分子工程實驗 指導老師：李振綱 教授 楊佩芬 學姊 簡良榮 學長 組員： A9306042曾楷翔 A9306052高鴻哲 A9306074張家健 A9306082余亭緯 目錄 細菌細胞的測定………………………………………………………………………p.2 生長曲線…………………………………………………………………………………p.2 Micropipet使用………………………………………………………………………p.2 分光光度計使用…………………………………………………………………………p.3 培養基製作、劃菌、勾菌…………………………………………………………………p.4 生長曲線測定……………………………………………………………………………p.4 DNA分離與分析……………………………………………………………….…p.7 質體DNA分離(鹼溶裂法)…………………………………………………….………...p.7 洋菜膠電泳分析…………………………………………………………………………p.7 蛋白質之分離、純化與分析…………………………………………….…..p.10 離子交換層析分離…………………………………………………………...……… p.10 金屬層析分離…………………………………………………………………...…….p.10 蛋白質電泳………………………………………………………………….………p.10 酵素活性測定分析………………………………………………………….……p.13 酵素活性之維持………………………………………………………………………..p.13 反應流程………………………………………………………………………………..p.15 參考資料………………………………………………………………...…..p.19 細菌細胞的測定 生長曲線 一、目的 1.利用培養基的添加碳源不同，探討大腸桿菌E.coli在不同碳源環境下的菌株生長情形。 2.了解細胞如何產生代謝乳糖的機制 二、原理 1.當溶液內養分面臨不足時，細胞會開始想辦法利用其他的來源加以轉化成養分吸 收，同時也因為養分的不足而造成生長緩慢（甚至出現停滯） 2.當養分充足的時候，細胞只會吸收養分，而避免產生轉化的作用，產生不必要的反 應。反應速率圖如下 三、實驗步驟 (1) Micropipet使用： 依據吸取溶液體積選擇Pipet型號。 設定體積時，若由低旋到高值，則需超過設定值三分之一的刻度；若由高旋至低值，則直接旋至設定值。且在轉時避免超過設定值之最大與最小值。 套上適當Tip並以下圖方式吸取溶液，盡可能將Tip與液面垂直，且小心緩慢地操作。 釋放溶液時，將Tip接觸管壁，慢慢壓下按鈕至第一段，過1~2秒再壓下第二段。 注意事項： 勿將Pipet浸入溶液。 吸取酸液或具腐蝕性溶液後，請將微量吸管拆解開，各部位零件以蒸餾水沖洗乾淨，擦乾後再正確組合回復原狀。 微量吸管的任何部份切勿用火燒烤，亦不可吸取溫度高於 70℃ 的溶液，避免蒸氣侵入腐蝕活塞。 吸取黏度高溶液 HYPERLINK /RenderBody.asp?nPageID=181loc=4-3 ，請先將微量吸管頭尖端以刀片或剪刀將出口切大，並先行預潤後再吸取。 套有微量吸管頭的微量吸管，無論微量吸管頭中是否有溶液，均不可平放，需直立架好。 用完Pipet後，將其調回量取範圍最大值，以避免彈簧彈性疲乏。 (2) 分光光度計使用： A.基本操作 開機並設定儀器(若欲測定波長均在340nm以上，則需記得將Deuterium光源關閉)。 將空白試樣放入儀器中歸零，再放入樣品量取 B.牛血清蛋白濃度測定 1.取1mg牛血清蛋白溶於10mL蒸餾水，當標準液。 2.將標準液稀釋成不同倍率，作吸收度測定(與水比較)。 3.取吸收度在0.2~0.8的樣品(至少要五點)作檢量線 4.若標準偏差在0.999左右則Pipet及分光光度計應有一定技術水準。 (3) 培養基製作、劃菌、勾菌： A. 培養基製作(LB)： 1.配製1%Bacto tryptone、0.5%Bacto yeast extract、1%NaCl，並以5N NaOH調至pH7.0。(%為重量百分比) 2.用濕式滅菌法滅菌30分鐘。 3.待冷卻至50度左右，便在無菌操作台視需要決定是否加入抗生素 (A液) 。 4.若在步驟(1)中加入Agar，便可利用倒在培養皿來作LB-plate。 B. 劃菌落： 1.以滅菌牙籤(或鉑銥圓環)沾取菌落，並在上法所作之plate以下圖方式劃出橫線。 2.將培養