8-1機器分析第蛍光光度法-hoku-iryo.pdfVIP

7-1 基底状態 吸 収 励起状態 放 出 透 過 光（ルミネッセンス） 電磁波（光） 熱、電気、音 励起状態 （一重項） 基底状態 （一重項） ΔE 基底状態 （一重項） ΔE 蛍光 励起状態 （三重項） リン光 基底一重項 励起三重項 励起一重項 蛍光 リン光 基底状態のエネルギー順位 （振動、回転エネルギー順位 も含まれるため幅がある） 項間交差 励起光 電子遷移と蛍光?リン光 励起状態の エネルギー順位 励起一重項より基底状態 寿命が短い (1 x 10-4 秒以下） 励起三重項より基底状態 寿命が長い（ 1 x 10-4 から 数秒） ストークスの法則 蛍光 リン光 エネルギー 励起光＞蛍光＞リン光 波長 励起光＜蛍光＜リン光 振動数 励起光＜蛍光＜リン光 機器分析第8回 蛍光光度法 8-1 7-2 光源 分光部 試料部 検出記録部 キセノンランプ アルカリハライドランプ レーザー 水銀ランプ 光電子増倍管 フォトンカウンター 透過光 励起光 蛍光、リン光 回折格子 プリズム 四面透明な石英製セル 装 置 (蛍光光度計） C O COO- -O C O COO- -O O フェノールフタレイン フルオレセイン 蛍光性あり 蛍光性なし 蛍光と化学構造 ☆ 二重結合が存在すること p → p* 遷移 ☆ 重原子(ハロゲンなど）が存在するとリン光性 項間交差が起こりやすくなる ☆ 平面構造 共役により安定化する 濃度 (C) と蛍光強度 (F) の関係 F = K I0ΦεCL K : 蛍光定数 I0 : 励起光の強さ Φ: 量子収率 （発光した分子数/光吸収した分子数） ε: モル吸光係数 C : 濃度 L : 層長 濃度は蛍光強度に比例 濃度 蛍 光 強 度 8-2 7-3 蛍光測定法（定性分析） 励起スペクトル ： 蛍光波長を一定にし、励起波長を変えて強度を測定 蛍光スペクトル ： 励起光波長を一定にし、蛍光波長を変えて強度を測定 蛍 光 強 度 蛍光波長 (nm) 波長一定 各波長の強度測定 蛍 光 強 度 励起波長 (nm) 測定範囲波長 一定波長の強度測定 物質が何であるかを調べるためにそのスペクトルを比較する 蛍光ラベル化剤 測定試料 無蛍光 蛍光試薬 反応 蛍光ラベル化体 高感度化を計るため、蛍光試薬と結合させ その蛍光強度を測定する 代表的な蛍光試薬 -NH2, -COOH と反応して、 蛍光ラベル体生成 -OH と反応して、 蛍光ラベル体生成 8-3 化学発光法 (Chemiluminescense method) 基底 状態 ＋ 基底状態 基底状態 励起 状態 光 (ケミルミネッセンス） 化学発光法 反応 基底状態 吸 収 励起状態 放 出 透 過 光 （ルミネッセンス） 光 蛍光光度法 化学発光の原理 hn A B C ＋ S P ＋ ＋ C C ＋ D D D hn ： 励起分子 FERCL ΦΦΦΦ ??? 化学発光量子収率 ： CLΦ 反応により、どれだけの光が効率よく出るかを表す 割合（蛍光量子収率）出光励起分子:Φ 合（励起収率）励起分子が生成する割:Φ 収率）化学反応の収率(反応:Φ F E R すをが ファイと読みます 7-4 8-4 １．化学発光測定装置 ２．測定方法 A バッチ法 ： 試料と発光試薬を直接混合し、 反応液の発光強度を測定 試料 発光試薬 混合 発光試薬 試料 B フロー法 ： 発光液を連続的に流しておき、 試料を添加していく ３．化学物質の反応機構 b) ルシゲニン 試料室：暗室部（迷光の無い） 測定部：光電子増倍管、フォトンカウンター a) ルミノール Flu color ジフェニルアントラセン 青 フェニルエチニルアントラセン 緑 テトラセン 黄緑 クロロフェニルエチニルアントラセン 黄 ローダミン６Ｇ 橙 ローダミンＢ 赤 c) 過シュウ酸エステルとサイリューム 7-5 8-5 グルコース 尿素窒素 クレアチニン 尿酸 各種酵素 酸化剤(O2) H2O2 化学発光の応用 化学発光試薬 hn 各種生体成分を酸化酵素で処理すると H2O2 が発生 H2O2 量は成