生物信息学与PCR课件.pptVIP

第九章 聚合酶链反应 （Polymerase Chain Reaction. PCR） 一、问题提出 背景:  分子生物学、遗传学的兴起， 反向生物学的诞生 （核酸、遗传物质，基因型→表型）。 共同障碍： 如何在短时间内快速、获足够量、纯净的、 特异的目的DNA片段/基因供使用，可检测。 1．基础理论研究的需要  DNA重组、基因克隆、HGP测序，探针制备 2．实际应用的需要  基因工程（基因表达）、基因诊断、基因治 疗，基因预防等给人类带来希望。 二、PCR的基本概念 概念 由一对引物介导，在体外对特定DNA片段进行 快速、酶促、扩增技术。 以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 前提：人工合成一对特定引物作向导， 始动DNA合成。 酶促：体外试管内进行酶促生化合成 （非化学合成）。 靶子：特导扩增目的靶序列（目的）。 高效：极微量模板、百万倍扩增 快速：短时高速完成实验。 三、PCR工作原理 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR过程：3步曲 + 1循环 高温变性 90～97℃ 降温退火 45～55℃ 适温延伸 72℃左右 反复循环 分四个阶段讲述其原理：（一）高温模板变性  制备好含有扩增靶序列/目的基因的样品DNA （模板DNA）。然后在高温下（90 - 95℃）使双 键模板DNA变性，解链，获得单链模板DNA，为DNA 合成作好准备。（二）降温引物退火 合成一对特导性引物，在25 - 55℃温度下， 引物与模板配对结合。 引物的作用有三：定位、定向、定大小 2．定向： DNA链有方向性从5′端到3′端，引物 结合也有方向性。 ① 引物和模板DNA 3′端结合， ② 以引物为起点的新合成链，5′端锁定。 遵循DNA合成5′端到3′端的方向性， 引物只能3′端延伸， ③ 两条引物3′端均指向靶序列。 在高温模板变性反应体系中，加入过量（浓度大，引物数量多）的一对引物，在较低温下（25 - 50℃）大量的引物分别与各自相对应的单链模板DNA互补补严格大碱基配对，由于引物量大，长度小，其退火、结合的速度远高于模板单链DNA之间的结合。 （三）适温引物延伸（适温新链合成） 加入选定的DNA聚合酶，在其适宜温度（Taq 酶为65 - 72℃）进行DNA酶促合成反应，反应体系中的4×dNTP（底物A、C、G、T四种核酸），在引物3′端，在模板序列指导下，开始合成，即引物自5′→3′端延伸，合成一条与模板互补 之新链。 反应体系中DNA产量增加一倍，（原模板+新合成DNA，半保留复制），若以此产物DNA总量为模板重新合成反应，新反应体系中模板量实际将增加一倍。 （四）循环指数扩增  重复前三个步骤， 由于每次循环后产物可作为下一次反应模板，DNA总量和模板量均较上一次循环增加一倍， 反复多次累积呈指数增加，如一分子DNA成单链后两个模板，一次循环后变为2分子DNA，变性后有4个单链模板，30次循环的 230呈百万倍增加。 PCR 循环 – 第一步 – 加热变性 PCR每次循环扩增一览表 (n≠0) 循环 起始模板 5′端锁定长链 短链靶序列 总拷贝数 0 2 0 0 2 1 2 2 0 4 2 2 4 2 8 3 2 6 8 16 4 2 8 22 32 …………………………………………………… 20 2 40 105 220+1 n 2 2n 2n+1-2n-2 2n+1 (恒定不变) (线性增加)(近似指数增加) (指数增加) 从表中可知， 20次PCR循环后，反应产物DNA链拷贝数220 起始模板可略去不计，5′端长链数40个，只占总数40/220≈3.5×10-5.