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PCR的原理和应用 体内DNA复制的过程 类似于DNA的天然复制过程： 1.半保留复制 2.半不连续合成 :一条链是连续合成的(前导链leading strand), 而另一条链（随从链，lagging strand）是不连续合成的：冈琦片段。 3.合成过程： 3.1合成起始 a.螺旋的松弛与解链:拓扑异构酶 ;解链酶 （helicase） ,单链结合蛋白（SSB） b. 引发 ：引物酶（primase）以DNA为模板，自5‘→3’合成RNA小片段约十几到几十个核苷酸。 引发前体（preprimosome） ?㈡ DNA链的延长 反应体系：DNA模板，DNA聚合酶，dNTP， 引物，Mg2+ ?反应式：DNA+dNTP→（DNA）n+1+ppi DNA 聚合酶：催化5‘→3’ DNA合成；3‘→5’外切酶活性：去除 错误碱基，有校对作用； 5→3外切酶活性，去除RNA引物及修正错误碱基。 ㈢终止 连接酶（ligase）：使相邻的DNA片段,以3,5磷酸二酯键相连，需ATP供能。 PCR 技术的基本原理 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：93℃-96 ℃ ②模板DNA与引物的退火(复性) ：50 ℃ -68 ℃ ③引物的延伸：60 ℃ -75 ℃ 35-40 循环。 PCR反应体系 1. DNA模板 2. dNTPs 3.引物 4.taq 酶 5. mg2+ 6. 反应缓冲液（保持一定的PH值） 影响PCR的因素 1.引物 引物决定了：扩增片段的大小 扩增片段的特异性 引物设计的注意事项 2.DNA模板 纯度、浓度 3.taq 酶 酶的活性 4.mg2+离子浓度 5.缓冲液的PH值 RT-PCR 通过逆转录酶的作用，将RNA逆转录为cDNA，再通过PCR 扩增得到大量的cDNA双链以便分析。 RT-PCR PCR动力学 S型曲线 指数增长期 平台期 Teal time PCR 原理 TAQMAN 探针 淬灭基团： 报告基团： Real-time PCR 的应用 一：病原体 二：遗传病 三：基因表达 * * *
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