荧光定量PCR在临床医学中的应用解决方案.ppt

荧光定量PCR在临床医学中的应用 内容提要 基因诊断技术简介 概念 PCR与基因诊断技术 基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。 Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。 九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。 荧光定量PCR技术 实时荧光定量PCR技术，是指在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，通过标准曲线对PCR终产物的分析，最终实现对未知的起始模版进行定量分析的一种技术，是迄今对已知基因序列的核酸测定中最灵敏的方法。 荧光定量PCR技术的优点 特异性强：直接扩增病原体的特异DNA或异常基因片段 灵敏度高：可检测到极少量的DNA，有效降低漏诊率 高效省时：扩增周期短，有利于快速诊断 取材范围广：血清、痰液、体液、毛发等多种样本 全封闭反应：无需PCR后处理，降低污染 定量准确：利用标准曲线法，采用对数期分析 自动化程度高：操作安全，避免人为判断 荧光定量PCR技术的临床应用 病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因检测 性病相关病原体（CT、NG、UU、HPV）的基因检测 优生优育项目诊断：人巨细胞病毒（HCMV）、单纯疱疹病毒II型（HSV）、弓形虫（TOX）、风疹病毒 其它病原体检测：结核杆菌、肺炎支原体、EB病毒、伤寒杆菌、幽门螺旋杆菌等 乙型肝炎的病原检测 乙肝如何传染？ 慢性HBV感染 病毒持续6个月未被清除者 免疫耐受期：HBV复制活跃 免疫清除期 非活动或低复制期 慢性乙型肝炎 HBeAg阳性慢性乙型肝炎 HBeAg阴性慢性乙型肝炎 乙型肝炎肝硬化 代偿期肝硬化 失代偿期肝硬化 HBsAg与抗HBs HBsAg在感染HBV两周后即可阳性。只要HBsAg阳性就可诊断HBV感染，阴性则不能排除HBV感染。 抗HBs为保护性抗体，阳性表示对HBV有免疫力。 HBsAg和抗HBs同时阴性： 即所谓窗口期，此时HBsAg和抗HBs都未产生。 HBsAg和抗HBs同时阳性： HBV感染恢复期，此时HBsAg未消失，抗HBs已产生。或者是亚型感染。 为什么HBsAg阴性不能排除HBV感染？ 窗口期 检测试剂不够灵敏 隐匿性慢性乙肝（S基因变异） 重叠HCV感染（干扰HBsAg合成） 抗HBs阳性就万无一失了吗？ 单一抗HBs阳性HBV DNA检出率0-11.8% 先后感染了不同的HBV亚型 HBV病毒S基因变异 如何诊断血清HBsAg阴性的HBV感染？ 提高检测敏感性 采用针对变异抗原的检测试剂 HBV DNA的检测！ HBeAg与抗HBe HBeAg的存在表示病毒复制活跃且有较强的传染性。HBeAg消失而抗HBe产生称为血清转换。抗HBe阳转后，病毒复制水平低，传染性降低。 但长期抗HBe阳性者并不代表病毒复制停止或无传染性，研究显示20%～50%仍可检测到HBV DNA，部分可能由于前C区基因变异，导致不能形成HBeAg。 HBeAg与抗HBe共存？ 处于血清转换过程中 野生株与变异株同时存在 HBeAg水平与HBV DNA的关系 HBeAg阳性标本HBV DNA检出率90％左右 HBeAg与HBV DNA有着良好的相关性 HBeAg阴性/抗HBe阳性/HBV DNA阳性 HBV DNA水平一般较低 HBV低水平复制 HBV病毒前C区基因变异 重叠HCV感染 “两对半”缺陷 “两对半”是机体的免疫反应状态，为间接指标。 “携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。 HBsAg阴性或HBeAg阴性不能排除HBV感染。 HBV DNA 是病毒复制和传染性的直接标志。HBV DNA定量对于判断病毒复制程度、传染性大小、病毒药物疗效等有重要意义。 HBV DNA检测的临床意义 HBV DNA是HBV存在最直接的依据 HBV DNA是HBV复制的标志 HBV DNA是患者具有传染性的标志 HBV DNA对乙肝两对半起补充作用 HBV DNA是目前判断乙肝抗病毒药物疗效最敏感的指标 HBV DNA可检测出隐匿性慢性乙型肝炎 HBV DNA检测的临床意义 调查表明并不是所有“大三阳”的病人都处于HBV复制期，具有传染性；也不是所有“小三阳”的病人HBV都无复制。因此，要准确知道HBV是否处于复制状态，最准确的方法还是通过检测HBV DNA来决定。 HBV DNA检测方法 斑点杂交（