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此方法可能很多师兄师姐们都在用,只是当时的确没有找到相关的详细说明,学弟再次把自己摸索出来的一点心得写出来,高手就多多指正,没做过的就相互学习下,见笑)由于课题组所需,我需要构建数量可观的真核表达载体和融合载体起初我也查到相关菌落PCR的文献,和导师商量,导师一口回绝了他的理由和我所搜集到的理由一样:假阳性我们实验室一博士师姐需要做一个真核表达载体挑选了60个菌落,运用目的基因的上下游引物做PCR,出来条带的有有52个按照经验选取比较亮的14个提取质粒,酶切和PCR双鉴定结果仅有一个为阳性克隆,其余??为假阳性(假阳性主要考虑来源于未与载体结合的插入片段)也难怪老板一口回绝只是我需要做的基因太多,最凶猛的时候我一个星期要用两个200次的TianGen的质粒小提,累死人不偿命后来我自己对着图谱研究了一下(我所使用的是pCDNA3.0载体、pCDNA3.1 myc his C载体和pEGFP载体)
HYPERLINK /attachment.php?aid=16699k=67d7a197a3007d6fe7955dbd61acbf0dt=1242997059nothumb=yessid=95e2z5qdnbJBUIS9yNc2mIFyyBg1CiStORVyJz0KoK%2FytVE \o pic01.jpg \t _blank 下载 (44.67 KB)
2009-3-29 21:03
.0的MCS两端有T7和SP6如果我用T7和SP6作为引物,则1.P出大小约150bp的片段,则为MCS序列,无插入片段2,若有插入片段,则应该为目的大小+152bp如下图所示:
HYPERLINK /attachment.php?aid=16700k=6de0cae65ec7b5ed5dat=1242997059nothumb=yessid=95e2z5qdnbJBUIS9yNc2mIFyyBg1CiStORVyJz0KoK%2FytVE \o pic02.jpg \t _blank 下载 (14.26 KB)
2009-3-29 21:03
后再改进为T7+目的基因下游引物(目的基因-R),或者目的基因上游引物(目的基因-F)+SP6因为即使用T7+SP6证明有插入但也不能确定为目的片段这样既解决了假阳性也解决了基因的特异性问题如下图:
HYPERLINK /attachment.php?aid=16701k=0c7531ac092e3d968cdf8c2522211c9dt=1242997059nothumb=yessid=95e2z5qdnbJBUIS9yNc2mIFyyBg1CiStORVyJz0KoK%2FytVE \o pic03.jpg \t _blank 下载 (16.07 KB)
2009-3-29 21:03
总结如下:1.PCR引物的选择( 此点至关重要,这也是菌液PCR的独特魅力所在)? ?选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物如:pCDNA3.0载体:T7+目的基因-R? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 或SP6+目的基因-F? ?? ? pCDNA3.1 myc his C(只有上游T7无下游SP6):T7+目的基因-R? ?? ? pEGFP(MCS两侧无通用序列):自己设计靠近两侧的特异性引物(也可以求助于测序公司,如:上海英骏/Invitrogen,他们有绝大多数载体的测序用的引物序列)仔细的阅读你的载体图,选择针对阳性重组子的特异性引物组合2.菌落的处理(我用的是质粒小提,用15ml离心管摇菌,通常加5ml培养基)挑取新鲜菌落于含抗性的(LB)培养基中37°C 200rpm摇床??摇2-4小时以上(通常赶时间的 话我就在摇后3小时做,这时我的PCR循环数就要相应多些,设置为32-35个循环,若不赶时间的话,我都是取摇过夜的活化菌做模板,此时我的PCR循环数就相应少些,一般28-30个循环)3.菌液的处理无需特殊处理菌液 ??或? ?取1-2ul菌液稀释为100倍体积,沸水浴10-15mins? ? 甚至于在稀释体系中按1/1000加triton(这个我没做过)提出加triton的人说这是为了破膜,以便能够释放出带目的基因的质粒,不过我觉得此步骤多次一举,细胞
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