益氣活血药对心肌组织及H9C2细胞Cx43表达和凋亡的影响.pptVIP

益气活血药对心肌组织及H9C2细胞Cx43表达和凋亡的影响 吴爱明，娄利霞，高永红，张冬梅，朱海燕，王硕仁 北京中医药大学东直门医院 中医内科学教育部和北京市重点实验室 主要内容 研究背景 心肌缝隙连接蛋白43 心肌细胞凋亡 心血管系统疾病是危害人类健康的常见病。心肌缝隙连接蛋白43和细胞凋亡的异常在心血管疾病的发病过程中都扮演了重要角色。 心肌缝隙连接蛋白43(CX43) 缝隙连接是一种特殊膜结构，由两个连接子对接而成，每个连接子包含来自毗邻细胞的六个连接蛋白，直接连接两个细胞的胞质，允许相邻细胞间电信号和化学信号的直接通讯。连接蛋白家族有20多个成员，就心室而言，表达最丰富的是Cx43。 Cx43是维持心肌细胞间化学偶联和电偶连的关键结构 心肌缺血时，Cx43分布和表达异常会导致心肌细胞电偶联的缺失，易于发生室性心律失常甚至猝死 。 并且Cx43的异常还会导致心肌细胞间的代谢障碍。 心肌细胞凋亡 细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种生理现象，但病理状态下细胞凋亡的增加与心肌缺血、缺血再灌注损伤和心力衰竭的发生都密切相关。 过度的细胞凋亡会加速心肌细胞的丢失，造成心功能的恶化，并促进心室重构的发生和发展。 材料与方法 实验材料 实验动物 雄性SD大鼠，体重200～240g，许可号：SCXK（京）2006-0009。 实验细胞 Rat H9C2心肌细胞系（ATCC? Number：CRL-1446?） 实验用药 生脉注射液（红参、麦冬、五味子），10ml/支，雅安三九药业有限公司（批号：100301） 血塞通注射液（三七总皂苷），250mg/10ml/支，昆明制药集团股份有限公司（批号：10DL04）。 主要试剂 兔抗Cx43多克隆抗体（批号 Hoechst凋亡细胞核和凋亡小体染色试剂盒 （#C1100） 实验方法 整体实验分组与给药方法 大鼠随机分为： 益气活血组：生脉注射液联合血塞通注射液 卡托普利组：卡托普利 模型组：生理盐水 假手术组：生理盐水 连续给药一个月 心肌梗死大鼠模型制备 参照文献，采用冠脉结扎法制作大鼠心肌梗死模型。 ——王硕仁,王振涛,赵明镜,李敏.心气虚病证动物模型及其评价体系的构建.中国实验动物学报.2002;10(1): 33-38. 心梗模型大鼠心电图和心脏超声评价 结扎冠脉前 结扎冠脉后 模型组 心功能比较 采用心电图和心脏超声评价心梗大鼠造模是否成功。 术后与术前比较，大鼠心电图ST段明显抬高。 取材前超声检查显示模型大鼠左心室内径明显扩大，室壁变薄，收缩运动减弱，心功能降低。 在体电刺激诱发室颤实验方法 参照文献，大鼠麻醉后固定，呼吸机辅助呼吸，开胸暴露心脏，连接刺激电极。 采用程控电刺激诱发室颤，记录室颤阈值。 ——柴松波,王硕仁,姚立芳,等.参松养心胶囊对大鼠心梗后心肌重构和和室颤阈值影响的研究.中国中药杂志.2009,34(16):2101-2104 细胞实验分组与给药方法 正常对照组 模型组 血塞通低剂量组 血塞通高剂量组 细胞实验以大鼠H9C2心肌细胞系为研究对象，分为两个实验。 实验1：生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞Cx43损伤的影响 实验2：生脉联合血塞通注射液对H9C2细胞凋亡的影响 两个实验均分为以下八组 生脉低剂量组 生脉高剂量组 生脉和血塞通低剂量组 生脉和血塞通高剂量组 细胞实验1：诱导H9C2细胞Cx43损伤的方法 参照文献，采用TPA造成Cx43的损伤 。 TPA是一种蛋白激酶C的激活剂，可以增加Cx43的磷酸化，从而降低Cx43通道的通透性，还能显著地降低缝隙连接的组装，并使Cx43失去稳定性。 ——Lampe PD, TenBroek EM, Burt JM, et al. Phosphorylation of connexin43 on serine368 by protein kinase C regulates gap junctional communication[J]. J Cell Biol, 2000, 149(7): 1503-1512. ——Lampe PD,Lau AF. The effects of connexin phosphorylation on gap junctional communication[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(7): 1171-1186. 细胞实验1：H9C2细胞Cx43检测方法 采用免疫细胞化学法检测Cx43的表达 主要步骤：用4%多聚甲醛固定细胞15min，血清封闭，滴加1:100稀释一抗4℃孵育过夜。次日加二抗，37℃孵育30min，DAB显色，倒置显微镜拍照观察。 细胞实