专题5-3《血红蛋白的提取和分离》选编.ppt

3、凝胶色谱法分离蛋白质的原理 （四）纯度鉴定 * * * 教学目标 教学重点 教学难点 理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理 了解缓冲液的组成及其作用 血红蛋白的提取和分离操作 凝胶色谱法的原理 电泳法分离大分子的原理 问题1： 蛋白质的分离的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 问题2： 蛋白质的分离的方法？ 1、凝胶色谱法（分配色谱法） 2、凝胶电泳法 一、基础知识： ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、凝胶： 2、分离依据： 分离的蛋白质的相对分子质量的大小 大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快； 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子 的差速流动。 1、概念： ㈡ 缓冲溶液(洗脱剂)： 2、作用： 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性） 2、原理：在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ） 移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。 所带电荷相反的电极 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 ㈢电泳： 1、概念：指带电粒子在电场作用下发 生迁移的过程。 二、实验操作－－实验步骤 样品处理 粗 分 离 纯 化 纯度鉴定 1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 透析血红蛋白 方法： 方法： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶色谱法 方法： 1.洗 涤 红 细 胞 思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤过程： 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速短时间离心 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 生理盐水 搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有黄色 （一）样品处理 2.释放血红蛋白 阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？ 为了加速释放过程，采取了什么措施？ 目的分析： 加蒸馏水的作用是_____________________。 加入甲苯的作用是____________________。 充分搅拌的目的是___________________。 使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂 （一）样品处理 3.分离血红蛋白 红细胞 混合液 高速离心 10min 离心管 滤纸 过滤 脂溶性沉淀层 烧杯 （一）样品处理 分液漏斗 ——透析血红蛋白 20mmol/L磷酸缓冲液 1mL 1mL （二）粗分离 血红蛋白溶液 透析的目的：去除样品中小分子的杂质 （三）纯化－－凝胶色谱法 1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 3.样品的加入和洗脱 材料： 交联葡聚糖凝胶 20mmol/L磷酸缓冲液 2.凝胶色谱柱的装填： （三）纯化－－凝胶色谱法 3.样品的加入和洗脱 （三）纯化－－凝胶色谱法 ◆凝胶色谱法纯化的目的是： 去除相对分子量大的杂质 方法： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 *