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流式細胞應用 - 細胞存活之檢測 傳統檢測細胞存活方法多以鏡檢得知大概情形，無法有效直接反應出細胞死活真實狀況，尤其是細菌死活之辨識常因細菌培養太過耗時而失去時效性。而那些生長緩慢的細菌或是無法培養的活菌等，若使用傳統方法，解析能力差，無法獲得立即細胞資訊。流式細胞分析技術的發展提供一快速檢測且可靠的方法定量真核細胞及原核細胞懸浮液中存活的細胞數目1-3,7,8。大家一般所熟悉的是使用PI來偵測細胞存活或死亡，此篇文章則是介紹若是再加入另一個螢光染劑，利用雙參數可以多檢測出受傷的細胞。 實驗原理 BD Cell Viability Kit使用立即可用之thiozole orange (TO)及propidium iodide (PI)二種螢光染劑組合，應用流式細胞儀即可分辨活細胞、死細胞及受傷的細胞；此法可取代傳統人工鏡檢方法4-6。活細胞的細胞膜完整，像PI等染劑是無法進入活細胞內的。TO則具有浸透性，雖然會進入所有的細胞體內，但是活細胞與死亡細胞呈現出的螢光強度則有程度上差別；所以，即使那些被細胞碎片黏著的活細胞也可輕易地被識出。舉凡周邊血單核細胞(PBMC)、哺乳動物細胞株、細菌、及酵母菌等均適用此應用。 此試劑組包含了： Thiozole orange (TO), 42(M in DMSO – 會進入所有的細胞內 Propidium iodide (PI), 4.3mM in water – 僅會進入死細胞使其呈色 計數用螢光微球 in buffer with 0.1% NaN3 – 絕對計數之用 不含於此試劑組但仍必需之其他材料如下述： Staining buffer – PBS with 0.2% Pluronic? F-68 (BASF Corporation, Mount Olive, NJ, Cat.#，經0.22(m濾過使用。F-68為非溶解性界面活性劑，常使用於細胞培養液中，可降低樣品的背景值。 1mM EDTA (Sigma, St. Louis, MO, Cat.# ED2SS)，經0.22(m濾過使用。EDTA也可降低背景值，但是更重要的是EDTA可以打開格蘭氏陰性菌之LPS，協助染劑進入細胞內。陽性菌亦適用。 註：細菌染色時，可使用0.01% Tween?-20 (Sigma, Cat.# P-1379)代替F-68，此staining buffer也必須經過0.22(m濾過。 實驗方法 螢光染劑用量： TO及PI染劑用量，依檢測之細胞類型不同而異。 細胞濃度： 以PBMC為例，使用staining buffer稀釋細胞，製備成5X105 – 107 cells/mL。 培養的細菌，最佳濃度為5X105 – 9X106 bacterial/mL。 其他類型細胞，例如製藥用取樣、食品或環境取樣之檢體，製備成之濃度以流式細胞儀可偵測到至少100 cells/mL為主，再反推應製備之起始濃度為何。 細菌及酵母菌： 每種染劑各添加5(L於500(L細胞懸浮液中。 振盪後，於室溫下作用5分鐘即可上機。 染劑最終濃度：TO = 420nM，PI = 43(M。 哺乳動物細胞： 取4(L TO及2(L PI加入2mL細胞懸浮液中。 振盪後，於室溫下作用5分鐘即可上機。 染劑最終濃度： TO = 105nM，PI = 11(M。 公牛精液： 每種染劑各取2(L加入2mL細胞懸浮液中。 振盪後，於室溫下作用5分鐘即可上機。 染劑最終濃度： TO = 53nM，PI = 11(M。 注意：當併用計數微球時，微球須回溫使用。取微球前，必須先振盪30秒後，再使用反向取樣法(reverse pipetting)取50(L於每個樣品管內。須振盪後再上機分析。 資料收取與分析 閾值參數設定 哺乳動物細胞分析 – 設於FSC 微生物細胞分析 – 設於SSC 參數之放大模式 一般動物細胞：FSC – LIN, SSC – LIN, FLs – LOG 微生物：所有參數均以LOG放大 使用SSC vs FL2圈選欲分析之細胞群並作設門(Gating)4-6。 利用螢光強度區別活細胞與死亡細胞：使用FL1表示TO，FL3表示PI。(TO螢光強度主要呈現於FL1及FL2，PI主要由FL3呈現) 若使用絕對計數用螢光微球，則細胞濃度計算方程式為： 細胞區域之個數 預知之螢光微球總數(包裝上顯示) 微球區域之個數 樣品取樣體積((L) 使用低流速(LO)上機。 每秒鐘通過雷射區的流速 ( 1000 events。 若使用螢光微球，則螢光微球至少要收取1000顆。 分析結果： 圖一顯示E.coli細胞存活結果，R4為活細胞區域，R5為受傷細胞，R6則為死亡細胞。此實驗使用500(L E.