Genome Walking Kit (10次量).pdf

TaKaRa Code：D316 Genome Walking Kit （10 次量） 说明书 宝生物工程(大连)有限公司 目 录 内 容 页 码 ●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保 存 1 ●试剂盒原理 2 ●特异性引物的设计 3 ●实验时需要自备的其他主要试剂 3 ●实验操作流程 3 ●实验操作方法 4 ●注意事项 6 ●使用 Control Template 时的实验例 6 ●使用小麦基因组 DNA 时的实验例 8 10 11 ●QA ●参考文献 ●制品说明 染色体步移技术（Genome Walking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取 与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用： 1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因 的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究； 2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列； 3. 鉴定 T-DNA 或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等； 4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列； 5. 用于人工染色体 PAC、YAC 和 BAC 的片段搭接。 对于基因组测序已经完成的少数物种（如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等）来说，可以轻松地从数据 库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前， 想要知道一个已知区域两侧的 DNA 序列，只能采用染色体步移技术。 以 PCR 技术为基础的染色体步移的主要问题是在预先不了解未知区域序列信息的情况下，如何设计两个 特异性引物来扩增未知区域。而传统的染色体步移方法，如：反向 PCR 法、连接接头法等，都有操作复 杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。 本试剂盒是一种根据已知基因组 DNA 序列，高效获取侧翼未知序列的试剂盒。相对于其它传统方法，本 试剂盒具有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。其主要原理是根据 已知 DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer），与试剂盒中提供的四 种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物，即 AP1、AP2、AP3、AP4 进行热不对称 PCR 反应。通常 情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称 PCR 反应， 通过三次巢式 PCR 反应即可获取已知序列的侧翼序列。如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时， 还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。此外，本试剂盒中还含有 Control DNA 及 Control Primer，可以方便进行 Control 实验。 ●制品内容（10 次量） ⒈ AP1 Primer（100 pmol/μl） 30 μl ⒉ AP2 Primer（100 pmol/μl） 30 μl ⒊ AP3 Primer（100 pmol/μl） 30 μl ⒋ AP4 Primer（100 pmol/μl） 50 μl ⒌ Control Template（100 ng/μl）*1 10 μl ⒍ Control Specific Primer SP1（10 pmol/μl）*2 10 μl ⒎ Control Specific Primer SP2（10 pmol/μl）*2 10 μl ⒏ Control Specific Primer SP3（10 pmol/μl）*2 10 μl ⒐ TaKaRa LA Taq?（5 U/μl） 25 μl ⒑ 10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 1 ml