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·专 栏· ·中药与天然药· 福建道地药材枇杷叶ISSR 反应体系的建立与优化 李婷，徐榕青* ，林文津，张亚敏(福建省医学科学研究院，福建省医学测试重点实验室，福州 350001) 摘要：目的 建立适于福建产枇杷叶的ISSR 分析的PCR 反应体系，筛选适宜引物，并确定最佳退火温度。方法 改良 的CTAB 法提取嫩叶中DNA ，通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR 反应条件，利用梯度PCR 确定引物最佳退火温 度。结果 适于枇杷叶ISSR 最佳的反应体系为：总反应体积为25 μL ，其中模板DNA 60 ng ，Taq DNA 聚合酶0.9 U ， 引物浓度0.4 μmol·L1 ，dNTP 浓度200 μmol·L1 ，10×Buffer(含Mg2+) 2.5 μL ，加入灭菌去离子水至25 μL 。扩增程序为： 预变性94 ℃ 7 min ，变性94 ℃ l min ，复性最佳退火温度1 min，延伸72 ℃ 1 min ，35 个循环，72 ℃延伸 10 min。 在100 条引物中筛选出14 条扩增条带清晰且条带数目较多的引物，最佳退火温度为48~58 ℃( 因引物不同而异) 。结论 建 立了枇杷叶ISSR 最佳反应体系，筛选出 14 条引物并确定了最佳退火温度，为应用 ISSR 技术鉴定枇杷叶的种质资源和 遗传多样性研究奠定了基础。 关键词：枇杷叶；简单重复间隔序列；反应体系；优化 中图分类号：R282.2 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2012)04-0315-05 Establishment and Optimization of ISSR Reaction System for Eriobotryae Folium from Fujian * LI Ting, XU Rongqing , LIN Wenjin, ZHANG Yamin(Fujian Academy of Medical Sciences, Fujian Key Laboratory of Medical Testing, Fuzhou 350001, China) ABSTRACT: OBJECTIVE To establish and optimize the ISSR-PCR reaction system for Eriobotryae Folium; to screen the suitable primers and determine their optimal annealing temperatures. METHODS Genomic DNA was extracted by CTAB method from Eriobotrya leaves. The main influencing elements in different levels were tested by single factor experiment. The gradient PCR was used to determine the optimal annealing temperatures of each selected primer. RESULTS The optimized PCR reaction system: total response volume 25 μL, including 60 ng template DNA, DNA polymerases dosage for 0.9 U, primer eventual concentration of 0.4 mol·L1, dNTP eventual concentration was 200 μmol·L1, 10×Buffer(including Mg2+) for 2.5 μL, sterilization deionized water to 25 μL. The optimal amplified procedure was as follows: after a pre-denaturing of 7 min at 94 ℃, 35 cycles were performed with denaturing of