热诱导乳清分离蛋白纤维转换水解二硫键的形成.docVIP

热诱导乳清分离蛋白纤维：转换 水解 二硫键的形成 摘要：对单独的乳清蛋白和乳清分离蛋白的纤维形成进行了研究。WPI单体变成纤维的热诱导转换在pH2和低离子环境下随着加热时间和蛋白质浓度增加而增加。以往的研究，用了沉淀法、大小排除法，质子核磁共振光谱法，报道了很宽泛的转换的值的范围。现在发现一种替代方法，就是离心过滤，给出了一致的转换图片。目前的研究结果有助于解释文献中报道的差异。在pH2时，加热纯粹的乳清蛋白或纯的牛血清白蛋白没有形成纤维，而纤维会在纯的β-乳球蛋白和乳清分离蛋白溶液中形成。实验结果表明，β-乳球蛋白是唯一的参与纤维形成的乳清蛋白。在所有的乳清蛋白样品中，在pH2时加热会出现水解，正如用高校液相色谱和SDS测定的那样。当WPI纤维在pH2时形成在pH7或10贮存时，会在样品中形成二硫键。2006年艾斯维尔有限公司保留所有权利。 1 引言 许多蛋白质在中性变性条件下会变成纤维结构。一些纤维结构是自然发生的，像细胞骨架组件的肌动蛋白和微管蛋白，而另一些是人工发生的。各类食品中的蛋白质，像乳清蛋白、大豆蛋白、蛋清蛋白，也可以形成纤维，这取决于外界条件，如pH值、离子强度、蛋白质浓度、加热条件等。这些线性的蛋白质总量，例如，可以用来作为食品中的增稠剂。 乳清蛋白经常作为食品配料。商业乳清蛋白的成分，像乳清分离蛋白是从奶酪制造中获得的。最丰富的乳清蛋白是β-乳球蛋白，一个分子量是18400，半径为2nm的球状蛋白。蛋白质的等电点是pH值5.1。WPI是乳清蛋白的混合物，除了β-LG，还有其他的球状蛋白，如α-LG、BSA。在以往的研究中，我们知道纯的β-LG和WPI形成纤维需要在pH2和低离子强度下长期加热。这些纤维是半灵活的，在长度上是多分散的，在横截面上是单分散性的。在WPI样品中，β-LG很可能是唯一成为纤维一部分的蛋白质。 我们感兴趣的是乳清蛋白形成纤维的组装动力学来优化纤维形成。有几篇论文报道了β-LG在pH2和低离子强度下加热到80℃时的组装动力学。一个大的差异在已经报道的聚集蛋白的小部分的价值或者β-LG变成纤维的转变都能在文献中找到。这些价值可以通过各种办法获得。总而言之，当加热时间延长或者是增加蛋白浓聚物时，会观察到增加的转化。 Aymard 等人(1999)和Veerman 等人(2002)使用沉积法来测定在pH2和温度80℃下加热时β-LG单体变成纤维的转化。通过改变pH到接近等电点可以使聚集蛋白沉淀。留在溶液中的蛋白质假定成为非聚集蛋白。这种非聚集β-LG的浓缩用278nm下的UV光谱来确定。Aymard等人(1999)确定了经过长时间加热的β-LG质量分数为0.5%的聚集蛋白溶液的一小部分约45%。Veerman等人测定了大约43%的质量分数为0.5%的β-LG溶液和大约70%的质量分数为4%的β-LG溶液经过长时间加热的转化的程度。Schokker, Singh, Pinder, 和 Creamer (2000) 使用体积排阻色谱和多角度激光相结合来衡量聚集β-LG在pH2.5加热到80℃的一部分。经过4个小时的加热，我们分别从质量分数是0.5%和2%的β-LG的样品中测到聚集的部分从5%变到45%。Arnaudov 等人(2003)用质子核磁共振光谱来跟踪β-LG在加热到80℃pH2.5和低离子强度下的聚集过程。他们报道了大量的蛋白浓度低于一个很明显的聚集浓度大约2.5%的蛋白纳入到聚集蛋白的过程。很大部分β-LG转化成纤维都是在浓度明显高于临界浓度。 这一研究的目的是探讨乳清蛋白的热诱导聚集和乳清蛋白在pH2的混合物。对加热时间的影响、WPI的浓度、贮藏时的pH的研究，运用简单新型发展的方法来测定蛋白单体变成聚集体的转变。高效液相色谱和凝胶电泳被用来确定分子质量的分布和乳清蛋白样品成分。 2 原材料和方法 2.1 样品准备 纯的α-LA，β-LG和BSA从Sigma-Aldrich获得。WPI BiPRO从DSI.Inc获得。所有其他的化学品都用的是分析纯的。 WPI的分离和纯化用到Weinbreck, de Vries, Schrooyen, de Kruif (2003)所描述的方法，为了移除乳清蛋白聚集体。将WPI粉末溶解到蒸馏水中，用6M的HCl将pH调整到4.75。溶液在22600转下离心30分钟，用Sorvall RC-5B高速冷冻离心机，随后通过0.45nm的蛋白膜过滤(FD 30/0.45 mm Ca-S, Schleicher Schuell, Dassel, Germany)。其他的乳清蛋白粉末溶解在pH2的HCl溶液中。随后用HCl将PH调整到2，然后再相同条件下离心过滤。蛋白质浓聚物用UV光谱在278nm下进行测定。已知蛋白浓聚物的标准线是根据蛋白质粉末的