刘明明－如何从海洋中运用生物技术方法寻找新的酶.ppt.ppt

海洋微生物利用现状 海洋虽然蕴含了极大的微生物量 但是只有0.00.1-0.01% 是通过传统方法可以利用的 传统方法 培养依赖性的 分离培养 但是大多说微生物不能通过培养而获得。 16SrRNA 细菌种类不同，不同16S rRNA位点上的序列改变频率不同，因此，这些分子具有作为种系发生的指示所必不可少的性质。 总DNA提取----- PCR扩增16SrRNA ---- 16SrRNA克隆----- 16SrRNA序列分析 针对微生物分类 宏基因组学 宏基因组(Metagenoine) 即生境中全部微小生物遗传物质的总和 它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因， 目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。 宏基因组学(metagenomics)就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。 宏基因组学的研究过程 基因提取 纯化特定DNA进行克隆 插入载体 导入宿主细胞 序列和功能筛选 宏基因组学的技术方法 1.样品总DNA的提取及基因或基因组DNA 的富集 2. 载体 宏基因组文库的构建需要适宜的克隆载体 通常用于DNA克隆的载体主要包括质粒(Dlasmid)、粘粒 (cosmid)和细菌人工染色体(BAC)等。 质粒一般用于克隆小于10 kh的DNA片段，适用于单基因的克隆与表达。 粘粒(大部分是用pWE15载体，插入片段在40 kh左右)和细菌人工染色体(插入片段可达350 kb)已被广泛地用于大插入片段文库的构建中，以期获得由多基因簇调控的微生物活性物质的完整的代谢途径； 3.宿主 大肠杆菌(E．coli)依然是最理想的克隆和表达宿主. 青链霉菌(Streptomyce li idans)和其他的革兰氏阴性菌. 一些缺陷突变体也可作为宿主来进行文库的功能筛选 筛选方法 宏基因组学 在海洋微生物中发现新酶的应用 波罗的海海洋沉积物分离到一种低温活性脂肪酶，基因和假单胞菌的酯酶有54%的相似性 。这种酶可以应用到去垢剂、 造纸 、食品添加剂等 太平洋海洋沉积物里分离得到一种烷基羟化酶 ，是第一次在深海中描述一种烷基羟化酶。 挑战和未来的发展方向 海洋微生物的庞大数量要求有高通量的筛选方法 基于细胞的超高通量筛选 基于流式细胞仪的底物诱导表达筛选（ SIGEX ） 超大文库的构建 宿主能够高效表达， 且能形成有功能的翻译产物 结论 海洋中有许多特别的生态系统，如高温、高压、低温、高盐分等。这些环境提供了潜在的具有特定性状和应用价值的酶资源。 海洋微生物利用的很少，潜力很大。利用宏基因组学的方法可以发现新的酶服务我们的各个行业。 * * 如何从海洋中运用生物技术方法寻找新的酶 刘明明 2009.5 106/ml 20000个/m3 (室内) 微生物密度 非常多 多 环境类型 非常多 多 微生物种类 3.67*1030 ？ 微生物量 71% 29% 占地球表面积 海洋 陆地 Backgroud Why ? 原位裂解法 原位裂解法主要是通过去污剂处理、酶解法、机械破碎法、以及高温或冻融法等直接破碎样品中的微生物细胞而使DNA得以释放 。此法操作简单，成本低，DNA提取率高。 异位裂解法 先从样品中分离出细胞，再对细胞进行裂解，此法处理条件温和，所得DNA纯度较高，但操作繁琐，成本高，DNA提取率低。 根据序列筛选 根据功能筛选 底物诱导基因表达筛选 序列筛选策略是先从文库中获得目的基因，继而对之异源表达，得到具有生物活性的产物 功能筛选策略则是先获得具有生物活性的阳性克隆子，再通过插入片段测序，得到相应的基因结构 基于代谢基因表达一般通过相关底物诱导，在很多情况下由与代谢基因邻近的调控因子控制这一认识，而建立的一种调控表达的筛选方式