第五章固定化酶综述.ppt

第五章 固定化酶与固定化细胞;第一节 酶的固定化; 优点： ①极易将固定化酶与底物、产物分开，简化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定； ③可以在较长时间内进行反复分批反应 和装柱连续反应； ④?酶反应过程能够加以严格控制； ⑤?较游离酶更适合于多酶反应。 ;; 1．物理吸附法 酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。 常用载体：活性碳、氧化铝、硅胶、淀粉、纤维素、树脂。 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。 缺点：酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等。 ;2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶性载体的固定化方法。 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。 ;3.共价结合法 酶与载体以共价键结合的固定化方法。 ①?将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。 ②?在载体上接上一个双功能试剂（常用的如戊二醛），然后将酶偶联上去。 ;优点：酶与载体结合牢固，不易轻易脱落。 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，易引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心。 常用载体： 多糖、多孔玻璃、聚酯、聚胺、尼龙等 酶的功能团有：氨基或、羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。 ;常用的活化方法： 1）重氮化法： 载体：含有芳香族氨基。 酶的反应基团：游离氨基、咪唑基、酚基等。;2）溴化氰法： 载体：含羟基，即多糖类物质。 酶的反应基团：氨基 ;3）叠氮法;4．交联法 用双功能或多功能试剂使酶与酶之间交联的固定化方法。 不使用载体 常用的交联剂：戊二醛、异氰酸酯、双重氮联苯胺等。 酶的反应基团：N末端的α-氨基或赖氨酸ε-氨基、酚基、 巯基和咪唑基等。 ;;优点：结合牢固，可以长时间使用 缺点：因交联反应激烈，酶分子多个基团被交联，酶活损失大，颗粒较小???机械强度差，使用不便。 ;5.包埋法 酶分子包埋在高分子凝胶或高分子半透膜中。 载体：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、淀粉、明胶、胶原、海藻酸和卡拉胶等高分子化合物 ; 聚丙烯酰胺： 丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。海藻酸钠： 可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 。卡拉胶： 冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。;优点：很少改变酶的局级结构，酶活回收率较高。 缺点：有时酶也易失活，只适合作用于小分子底物和产物的酶。 ; 三、固定化酶的性质 (一)固定化后酶活力的变化 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小。 原因： ① 酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸； ②?固定化后，空间位阻会直接影响到活性中心对底物的定位作用； ③?扩散阻力使底物分子与酶的接近受阻； ;(二)固定化对酶稳定性的影响 1．固定化酶表现在热稳定性提高； 2．对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高。 3．对不同pH稳定性、对蛋白酶稳定性、贮存稳定性和操作稳定性都有提高。 ; ;稳定性提高的原因： ①?固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。 ②?酶活力的缓慢释放。 ③?抑制蛋白酶的降解, 阻挡了外界不利因素对酶的侵袭. ;（三）固定化酶的最适温度变化 最适温度提高。 （四）固定化酶的最适pH变化 对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移。 ;原因：微环境表面电荷性质的影响。 带负电荷载体：最适pH较游离酶偏高，即向碱性偏移。 带正电荷的载体：最适pH向酸性偏移。 ;(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。 载体与底物电荷相同：表观Km值显著上升； 载体与底物电荷相反：Km ？ ;四、影响固定化酶性能的因素 1．构象改变、立体屏蔽 构象改变：指固定化过程及酶和载体的相互作用，引起了酶的活性中心构象发生改变，从而导致酶活性改变的—种效应。 ;;立体屏蔽：指由于载体的孔径太小，或是由于固定化的方式与位置不当，给酶的活性中心或/和调节中心造成了空间障碍，底物与效应物等无法直接和酶接触，从而影响酶活性的一种效应。 ; 2．分配效应和扩散限制效应 分配效应：是由于固定化载体所带电荷及的亲、疏水性、使酶的底物、产物以及其他效应物在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反