3 第三讲2 常用分子克隆工具酶简介.ppt

常用工具酶简介 ;第一节 DNA连接酶(DNA ligase) ;;;2 DNA ligase简介 2.1 T4 DNA ligase 连接类型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA的黏性末端和平末端 ;2.2 大肠杆菌 DNA ligase dsDNA的黏性末端和平末端 ;;;;;;1 DNA polymerase分类;1.1 Ecoli DNA polymerase I 分类： DNA pol I DNA pol Ⅱ DNA pol Ⅲ;; Mn2+存在时 ;1.2 Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶I的枯草杆菌蛋白酶水解产物。 活性：5’ ? 3’聚合酶 3’ ? 5’外切酶;用途： ⑴ 3’-末端补平 ⑵ 3’-末端抹平 ⑶ cDNA第二链合成 ⑷ 双脱氧系统测序;3’-末端补齐 3’-末端标记 5’-ACGTTGCAAACTG-3’ 3’-TGCAACGTTTGAC…..5’ cDNA第二链合成 mRNA 3’-UGCAACGUUUGAC…..5’ c DNA 5’-ACGTTGCAAACTG GAC ;5’; 1.3 T4 DNA polymerase 特点： 5’→3’聚合酶活性 3’→5’外切酶活性 ;;1.4 Taq DNA polymerase 特点： 分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75-80℃ 。 5’-3’聚合酶活性 5‘-3’外切酶活性 用途： 主要用于DNA的体外扩增 ;Taq Pol 和PCR ;1.5 反转录酶(reverse transcripase) 用途： ⑴ cDNA第一链的合成 ⑵补平反应 ⑶用于DNA测序 ;;1.1 末端转移酶（TdT） ⑴ 反应特点 在酶的催化下将dNTP加到DNA分子的3‘OH末端，催化作用不需要模板。 ⑵ 用途 3’-加尾，便于两DNA分子重组 3’-末端标记 ; [γ-32P]ATP ATP ;1.2 T4 多聚核苷酸激酶 用途： 1) DNA或RNA的5’末端标记 2) 分子克隆过程中以获得5’-磷酸基末端，便于连接酶反应;1.3 碱性磷酸酶 用途 1) 载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率 2) 5’端 核酸末端标记 ; I II ;;;;1.1 S1核酸酶 特点： ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区 用途 1) 基因突变--缺失，常与外切酶，如ExoIII、λ外切酶、Bal31连用 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA结构分析 ;;;1.3 DNase I 用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口 ;ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口; Mn++存在时 ;;1.1 RNase ;1.2 RNase H; 5’—AAGCTT—3’ HindIII 5’—A AGCTT—3’ 3’—TTCGAA—5’ 3’—TTCGA A—5’ S1