耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选.pdf

第 32 卷第 8期 第 三 军 医 大 学 学 报 Vo.l 32, No. 8 2010 年 4月 30日 ACTA ACADEM IAE MEDICINAE M ILITARIS TERT IAE Apr. 30 2010 749 文章编号: 1000-5404 ( 2010) 08-0749-05 论著 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 PBP2a相互作用蛋白的筛选 原薇薇, 杨 杰, 王冬梅, 胡 珍, 朱军民, 陈志瑾, 张俊磊, 王嘉丽, 刘 佳, 饶贤才 ( 400038重庆, 第三军医大学基 础医学部微生物学教 研室, 重庆市微生物工程实验室 ) [摘要 ] 目的 通过建立细菌 双杂交 技术, 筛选 M RSA 中 与 PBP2a 相互 作用的 蛋白。方 法 利用 PCR 扩增, 获得 PBP2a蛋白转肽酶活性区 ( TP ase)的编码基因, 插入 pRBR 构建成诱饵质粒 pBR-PBP2a。提取 M RSA N315株基因组 DNA, 经 Sau3A? 部分酶 切后 连接到 pRA C质 粒的 B amH? 位点, 获 得基因 组 DNA 表达 文库; 将 文库质 粒转 化入含 诱饵 质粒 pBR-PBP2a的报告菌株 K S1, 利用 细菌双杂交技术进行筛选, 获得与诱饵 质粒编码的 融合蛋白 相互作用的 猎物, 对猎物中 编码序列进行 DNA 测序 和生 物信 息 学分 析, 确 定与 PBP2a 发生 相 互作 用的 蛋 白质 或多 肽。结 果 成功 构 建 了 pBR- PBP2a诱饵质粒, 可表达 PBP2a TP ase与大肠埃希菌 RNA 聚合 酶 A亚 单位 N 端序 列的融 合蛋白。所 构建的 M RSA N 315 株基因组文库覆 盖率达 9倍, 满足文库筛选的需要。将文库转化 含诱饵质 粒和报告 基因的 KS1宿主 菌, 利 用细菌 双杂交 技 术经 3次筛选, 共获得 9个猎物克隆, 其报告基因的活性均升高 2倍以上, 对 9个猎物质 粒进行了测序, 信息学分析表明 它们均来自于 M RSA N315株基因组, 插入片段最长 者 648 bp, 最短者 334 bp, 9个插 入片段中含 14 个编码基因, 其中 10 个功能未知, 1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶, 2个编码 染色体解离 稳定 ( SM C )蛋白。 9个 克隆中介导与 PBP 2a相互作用的多肽由 14~ 46个氨基酸组成。结论 利用细菌双杂交技术从 MR SA 基因组文 库中成功 筛选到与 PBP 2a相互作用的多肽。 [关键词 ] 基因组 DNA 文库; PBP2a蛋白; 细菌双杂交系统; 蛋白质间相互作用 [中图法分类号 ] R 378. 11; R 394-33; R 394. 3 [文献标志码 ] A Screening of proteins interacting w ith PBP2a in m ethicillin-resistant Staphy lococcus aureus Yuan W e iw e,i Yang Jie, W ang Dongm e,i H u Zhen, Zhu Junm ing, Chen Zhijin, Zhang Jun le,i W ang Jial,i L iu Jia, Rao X iancai ( Departm ent o fM icrob io logy, Co llege of Basic M edical Sc iences, Th ird M ilitary M ed i