实时定量PCR的操作流程详解.pdfVIP

116 生命科学趋势 生命科学论坛精华专题 - - 2003 年 12 月 第 1 卷 第 4 期 Trends in Life Sciences 用于检测细胞基因转录水平的实时定量 PCR 的操作流程 （Real Time Quantitative PCR Protocol For Detection of Gene Expression） 第一部分 原理 real time PCR 是普通 PCR 的一项改进，使用了针对扩增 DNA 的荧光物质，使得 DNA 的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到 DNA 的扩增曲线（如，图一）。 图一：引自美国应用生物系统中国公司网站——实时荧光定量 PCR ——一种科学准确 的定量方法。 名词解释： Rn:一个反应管经 n 次热循环后，测得的荧光强度。 Rn+:反应管含有模板 DNA。 Rn-:反应管含有模板 DNA。 无模板对照：No template control，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。 Threshold: 荧光（Rn）超过本底时的临界数值。 Ct: threshold cycle，临界循环数，threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。 基线：baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所 有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。 仪器：热循环仪器（GeneAmp Thermal Cycler 9600）+电脑（装有 Sequence Detection System 软件）+荧光检测系统(GeneAmp Sequence Detector 5700)（如，图二）。 117 生命科学趋势 生命科学论坛精华专题 - - 2003 年 12 月 第 1 卷 第 4 期 Trends in Life Sciences 图二，引自 /。 全部实验包括步骤： 1，类似普通 PCR 反应的物品混合于反应管，之外还要添加荧光物质（SYBR 染料 或 TaqMan 探针）。 2，使用 SDS 软件标明热循环仪器中放入的所有反应管，设定热循环仪器的温度变化，存储 热循环仪器的工作情况，存储荧光信号，分析 DNA 的扩增曲线。 3，利用 SDS 输出的数据，其他专业数据处理软件，近似计算得到原始 DNA 的浓度，做必 要的误差分析。 SYBR 是一种结合于所有 dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 TaqMan 探针是由产荧光基团，荧光淬灭基团，与扩增子有互补的核苷酸序列组