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高效液相色谱分析 一．实验目的: ? 1．? 了解并熟悉高效液相色谱仪的流程及定性方法。 2．? 掌握液相色谱外标定量方法。 ? 二．实验原理： 高效液相色谱法是利用待测样品的分子结构，极性，及分子量的不同，其在液体的流动相与固态的固定相之间的平衡分配系数也不相同。使得它们在色谱柱上的移动速度有差别，故在色谱柱上待测样品由混合样被分离成各个组分，再由紫外，荧光。示差等检测器对被分离的成分进行检测，经计算机色谱工作站对数据进行定性定量分析的方法。 分析流程： + 高效液相色谱仪一般具有贮液器、高压泵、梯度洗脱装 置、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、数据处理装置 等主要部件。 ? 在反相系统里, 固定相是非极性的, 流动相是极性的。在化学键和相色谱中, 反相固定相的配合基常是链长2—18碳原子的烷基。流动相一般为极性有机溶剂和水的混合溶液。溶质极性越大, 保留值越小。当流动相组成一定时, 样品在较长烷基配合基的固定相上的保留值较大。定性则根据已知标准样与未知样之间的保留值相比较。 ? 在高效液相色谱中, 标准曲线法即外标法是配制已知浓度欲定量组分的标准溶液，测量各组分的峰高，用峰高对浓度作出标准曲线。 ? ? 三．实验条件： ? 色谱仪：日立638—50高效液相色谱仪。 色谱柱；spherisorb C18 5um [4.6ⅹ200mm] 流动相：甲醇—水：85—15 流速：1.0ml/min 检测器：UV—254nm 温度：室温 数据处理器：EChorm98色谱工作站。 萘标准溶液浓度：20ug/ml、40ug /ml、60 ug /ml ? 四 实验步骤： ? 1分别称取适量的萘标准品于100ml 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。 2．取适量苯、萘、联苯混合样品于100ml容量瓶中作为未知样。 3首先打开主机总开关，然后依次打开紫外检测器，脱气器及色谱工作站的电源开关。 4．在主机的操作板上，打开手动开关。分别输入流速参数，浓度参数，压力上下限值，最后启动黄色的泵开关。将监视器定位在压力表上，观察压力值。 ? 5．调整检测器波长在254nm处，然后定位零点。观察色谱工作站中色谱图基线情况， ? 6．?待基线平稳后，用微量进样器分别取5ul标准溶液，由进样阀进样， 同时记录色谱图和保留时间。 7．? 取未知样品5ul进样，记录色谱图和保留时间 。 ? 五 数据处理： 1根据得到的标准曲线色谱图与保留时间，在未知样品谱图中确定每个峰的性质， 2求出回归方程和相关系数。 3? 用外标法计算未知样品的浓度。 六 问题讨论： 1．? 高效液相色谱分离方法分为几类？ 2．? 高效液相色谱的定量方法有那几种？ ．