重离子辐照玉米的SSR分子标记程序.ppt

重离子辐照玉米的SSR分子标记分析 ;基本步骤;1试验材料 选取由‘zC6+离子束辐照处理的玉米自交系CSR24001-1,鲁9801、金象4C-1和郑58、478、308。 1.1样品采集 供试材料选取籽粒饱满的玉米种子，用水浸泡3-5 h,蒸馏水冲洗，置铺于有蛙 石的培养皿中，于25 0C培养箱暗培养，待幼苗长至5-6 d后剪取叶片迅速放入冰盒， 以免水分散失。 2.1技术路线 该实验选取田间经不同能量、不同通量和不同处理的‘zC6+离子束辐照处理和未 辐射对照玉米种子实验室种植，选取幼嫩叶片为材料，进行玉米基因组DNA的提取， 选用可扩增引物进行PCR扩增，通过SSR分子标记的分析研究辐照植株与未辐射对 照植株之间的遗传变异并进行类群的划分，选出具有较大差异的材料。;2.2药品试剂及试验设备 2.2.1药品试剂 本试验所用化学试剂均为分析纯:TaqDNA聚合酶，琼脂糖，dNTPs溟化乙锭， 选用玉米通用SSR引物。 2.2.2仪器设备高速低温离心机， PCR扩增仪电冰箱，水浴锅，电泳仪，凝胶成像系统 。 2.3。1基因组DNA的提取 1 SDS快速提取法 2 CTAB法 2.3. 2DNA的检测 用TU-1810紫外分光光度计和0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。 2.4随机引物的筛选 在一定条引物逐一扩增，扩增产物经聚丙烯酞胺凝胶电泳后，再经银染，观察结果，从 中筛选出扩增条带数较多，扩增清楚的引物，用这些引物对供试材料再作进一步扩增。 ;2.5 SSR反应体系的优化 SSR体系的优化是以获得最佳的扩增能力SSR的扩增能力为尺度对模板DNA或其他 因素进行调整。 2.6 PCR扩增 扩增条件及PCR所用的程序包括:变性、复性和扩增的温度、时间以及循环的次数。 理论上扩增能够无限制地长期进行，但实际上受各种因素的制约。当循环次数少时扩 增产物的量对于某种分析太少，当循环次数过多时，扩增的量不再增加。通常在30-45 个循环。 2.7扩增产物检测 2.7.1胶的制备 加5-7 u1扩增产物与2 u1溟酚称取定量的10 % PAGE用干净的玻璃棒搅拌均匀. 2.7.2加样 加5-7 u1扩增产物与2 u1溟酚蓝于封口膜上混合 2.7.3电泳 接通电源，电压110 V，电泳1h ;2.7.4 银染 固定:(1)电泳结束后，小心分开两块玻璃板(胶会紧贴在玻璃板上)，将凝胶置 cm培养皿中，加入适量25%乙醇中，摇床固定5 min，此时胶己完全脱离玻 璃板 (2)水洗:将胶置于适量蒸馏水摇床漂洗1 min o (3)氧化:将胶置于适量1 % HNO:中摇床4-6 min (4)染色:将胶置于适量新配的2 % AgNO:中染色 (5)显影:加入100 ml新配的显色液(3g NaC03} 容至100 ml中轻轻摇动至条带完全出现。 (6)定影:将显出条带的胶置于适量10%乙酸中1 酸，保存拍照进行条带分析。;3数据分析 用蒸馏水冲洗2-3次。20-30 min，用蒸馏水冲洗1次。 200 u1甲醛，10 u1硫代硫酸钠定 2min左右，用自来水冲洗残留乙醇，SSR扩增带型以0, 1统计，建立数据库。在相同迁移率 位置上，有带的记为A，无带的记为B，统计每条引物扩增出的总带数和其中的多态性带数。 采用NTSYS-pcversion-2.0统计软件，按照NEh:法计算遗传距离，并利用UPGMA法进行 聚类分析，绘制树状图。 4结果与分析 4.1提取DNA的检测 基因组DNA的有效提取是进行任何DNA下游工作的前提和基础，有效提取指 的是得到的基因组DNA(总DNA)有足够的量，尽可能少的降解和不含有影响下一 步酶反应的杂质。 DNA在260 nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280 nm处有最大的吸收峰，盐和 小分子则集中在230 nm处。因此，可以用260 nm波长进行分光测定DNA浓度， OD值为1相当于大约50 ug/ml双链DNA。如用1 cm光径，用HZO稀释DNA样品 n倍并以HZO为空白对照，根据此时读出的OD26。值即可计算出样品稀释前的浓度: DNA ( ng/ml卜50 X OD26。读数X稀释倍数/1000 o DNA纯品的OD26o/ ODZs。为1.8，故 根据OD26o/ ODZs。的值可以估计DNA的纯度。若比值大于1.8说明含有DNA纯度高， 比值较低说明有残余蛋白质存在 ;4.1.1 DNA浓度检测 本试验所采用的CTAB法和SDS法。结果表明:2种方法均可从样本中提取到 一定纯度的DNAo SDS法提出的DNA的OD26。是 0.083 , ODZg。是0.062, OD26o/ODZgo 是1.34，此法操作简单，过程简便，所以损失的DNA最少，但