PCR操作规范1[教学].pptVIP

临床基因扩增检验操作规范 ;一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能 二、各阶段操作要求 三、PCR污染与对策 四、因操作欠规范导致的问题分析 ;一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能; 1. 四个隔开的工作区域中每一区域都须有 专用的仪器设备。 2. 明确的标记，如加样器或试剂等。 3. 单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、 标本 制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简 称扩增区）至产物分析区。 4. 使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。 5. 实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增 产物分析区的方向进行。 6. 各自的清洁用具。; 各室功能： ;（一）试剂贮存和准备区; 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。 戴手套。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（254nm波长）照射，一般照射过夜。 实验室及其设备的使用必须有日常记录。 ;（二）标本制备区; 要正确使用加样器。 正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。 为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。 用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成。 ;（三）扩增区; 已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。 在巢式PCR测定中，第二次加样必须在本区内进行。 可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。 如有加样则应在超净台内进行。 打开反应管前快速离心数秒。 ;（四）扩增产物分析区; 膜上微孔板上探针杂交方法、 Southern转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。 本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意实验人员的安全防护。 负压条件。 ;二、各阶段操作要求;（一）标本的采集;（二）标本的稳定化处理;（三）标本的运送;（四）标本的贮存;（五）标本的处理（核酸提取）; 操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴） 注意： ①离心管不能插得过低，以防进水； ②水浴时不能加盖，防管盖爆开； ③水浴时间须准确，10±1 min； ④水浴时不能走开； ⑤左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。;（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增;RT-PCR操作注意：;（七）扩增产物的分析;实时荧光定量PCR;TaqMan荧光定量PCR原理; ;撑厂闯娜仅腮酬烯抖关悔叁蕉男峰锑羞劳规宵釜剖莹滤蹭嫁描椅溪挑恕官PCR操作规范1PCR操作规范1;三、PCR污染与对策;要防止PCR污染，必须做好以下3个环节的工作： （一）污染的预防 （二）污染源的追踪 （三）污染源的处理 ;（一）污染的预防;3、改进实验操作： (1) 带一次性手套； (2) 避免反应液的飞溅； (3) 用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于 空气，以免产物气溶胶污染； (4) 操作多份样品时，要先将可混匀的成分 (dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准 混合液(Master mix)； (5) 制备反应混合液时，最后加入样品DNA， 加入DNA后，在进行下一步操作前要盖紧 反应管。 4、检查结果的可重复性。;（二）污染源的追踪 ;1、阳、阴性对照;2、常见的环境污染源有 ;追踪可疑的环境污染源;（三）污染源的处理 ;1. 环境污染处理法;2. 反应液的污染处理法;(2) 内切酶法： 选择识别四个碱基的内切酶（如MspI等），最好几种合用，可克服其识别序列特异的缺陷。方法同上，只是DnaseI由内切酶（MspI10U）代替，作用时间延长到1.0～1.5h。 (3) 紫外照射法： 反应中不加模板与Taq酶。 ;(4)