4氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力.docVIP

氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活力 原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：植物叶片。（二）仪器设备：高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为4000lx），试管或指形管数支，黑色硬纸套。（三）试剂（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。[0.2M的Na2HPO491.5mL和NaH2PO48.5mL混合后稀释4倍]or[0.05mol/L PBS缓冲液（pH7.8）：7.1g/L ，6.8g/LKH2PO4，按体积9:1混合，如pH高或低于7.8，则用KH2PO4或Na2HPO4调节。每1000mL缓冲液含8gNaCl，0.2gKCl] 提取介质：内含1%聚乙烯吡咯烷酮的上述缓冲液。（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。（3）750μmol/L氮蓝四唑溶液（NBT）：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （4）100μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。（5）20 μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存，现用现配。三、实验步骤1.酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于研钵中液氮研磨成粉末，加2ml预冷的提取介质在冰浴上研磨成浆，加入提取介质冲洗研钵，提取介质终体积为5ml。取1.5-2ml于4℃下10000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。2.显色反应 取5ml指形管或试管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液：[当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶和核黄素除外）按比例混合后每支试管一次加入2.65mL，然???依次加入核黄素和酶液，但终浓度不变。] 试剂名称用量（mL）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L100μmol/L EDTA-Na2溶液0.310μmol/L20 μmol/L核黄素溶液0.32.0μmol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光或置暗处，其他各管于4000lx日光下反应10min（要求各管受光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，温度高时间缩短，低时延长；视酶活性高低可适当调整反应时间）。3.SOD活性测定 至反应结束后，用黑布罩盖上试管，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管在560nm下的吸光度。四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。 式中： SOD——活性以每克鲜重酶单位表示，比活力以每毫克蛋白酶单位表示； A0——照光对照管的吸光值； As——样品管的吸光值； Vt——样液总体积（mL）； VS——测定时样品用量（mL）； W——样品鲜重（g）； 蛋白质浓度——每克鲜重含蛋白毫克数（mg·g-1）。 注意事项 1.核黄素产生 O2- ，NBT 还原为蓝色的化合物都与光密切相关，因此，测定时要严格控制光照的强度和时间。 2.植物中的酚类对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP），尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。 3.测定SOD活性时加入的酶量，以能抑制反应的50％为佳。