PCR过程与方法.docx

.2 主要试剂及仪器 RNA提取试剂盒（Trizol）购自MBI公司；反转录试剂盒购自Fermentas公司；PCR反应的试剂购自宝生物工程（大连）公司；DEPC（焦碳酸二乙酯）购自SIGMA公司；SYBR Green荧光定量试剂盒购自Toyobo公司；八联管购自Axygen公司；氯仿，异丙醇，无水乙醇等常规试剂购自上海生工生物工程有限公司。引物合成和测序由上海生工生物工程有限公司完成。 GE公司IQ300凝胶成像系统、ND-1000浓度测定仪、ABI 7500荧光定量PCR仪。 1.3 试剂配制 所有试剂配制同第二章。 2 试验方法 2.1 引物合成 选取Beta-actin基因作为内参基因[54]，根据GenBank中公布的鸡Pax-3、Pax-7基因的mRNA序列各设计1对引物。 引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。各引物的信息以及反应条件见表4-1。 表4-1 荧光定量PCR引物 Table 4-1 Primers used for RQ-PCR 引物编号 Number序列 Sequences片段长度 Size退火温度 Anealing temperatureBeta-actinF: 5’ GAGAAATTGTGCGTGACATCA 3’152bp60℃R: 5’ CCTGAACCTCTCATTGCCA 3’Pax-3F:5’ CTCGGGAAGAACTCGCACAA 3’150bp58℃R:5’ATGGAGGTGGGCTGATAGGATG3’Pax-7F: 5’CTGTCACCACCTCTTTGC3’142bp60℃R: 5’ TGGAAGCGGGTCACATA3’2.2 胸肌、腿肌总RNA的提取 2.2.1提取RNA前的准备工作 （1）玻璃制品用0.1 M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用超纯水冲洗2遍，180 ℃烘烤6 h； （2）匀浆器、电泳槽等用0.1 %的DEPC水冲洗浸泡，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0.5 %的SDS处理； （3）Tip头、EP管用0.1 %的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。 2.2.2 Trizol一步法提取组织总RNA 按照Trizol试剂盒说明书操作。 （1）取50 - 100 mg组织样（-70 ℃超低温冰箱中保存）放入研钵，加液氮迅速研磨成粉，转至匀浆器内，加入1 mL Trizol，冰浴中快速匀浆后转至1.5 mL的离心管中，冰上静置5 min； （2）加入0.2 mL氯仿，用手剧烈摇15秒混匀，15 - 30 ℃孵育2-3 min后，于4 ℃ 12000 rpm离心15分钟，取上层水相于一新的离心管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀后15-30 ℃静置10 min； （3）12000 rpm离心10分钟，弃上清，沉淀用现配的75 %乙醇洗涤，4 ℃ 7500 rpm离心5 min； （4）弃上清，室温干燥沉淀，干燥后加入30 - 60 μL的去离子甲酰胺以溶解RNA，-70 ℃保存。 2.2.3 RNA检测 （1） RNA的分光光度计检测 ND-1000测定提取的总RNA在260 nm和280 nm下测吸光度A值，并计算OD260/OD280的值以确认RNA的质量和产量。此值在1.7-2.1之间说明提取的RNA纯度较高，适宜进行下一步的实验（根据样品在260 nm波长处的吸光度值确定总RNA提取液中RNA的浓度，以便在反转录的过程中进行定量：1个单位OD260值单链RNA = 40 μg/mL）；若低于1.7，则说明提取的RNA中可能有蛋白质的污染，可用酚：氯仿抽提去除。 （2）RNA的电泳检测 电泳槽用RNA清洗液浸泡4-5 h，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入1×TBE待用。琼脂糖凝胶用1×TBE配制。在5 μL上样缓冲液中加入5 μL组织总RNA。65 ℃变性10 min后立即放入冰水中2-3 min，点样于琼脂糖凝胶中5 V/cm电泳，电泳待溴酚蓝至胶2/3处，取下凝胶，Gold View染色，凝胶成像系统检测电泳结果。 2.3 反转录 根据各样品总RNA的浓度，对各个个体的总RNA进行稀释，使最终浓度为100 ng/μL。反转录体系为20 μL：在一0.2 mL的PCR管中加入0.2 μg总RNA，oligo（dT）18引物0.2 μg，加DEPC处理水至总体积35 μL，4 ℃ 8000 rpm瞬时离心后，在PCR仪内70 ℃孵育5分钟，迅速置于冰上冷却，加5×Reaction Buffer （250 mM Tris-HCl （pH 8.3）, 250 mM KCl, 20 mM MgCl2，50 mM DTT） 10 μL, 10 mM dNTP