PFG克隆及表达.doc

绿色荧光蛋白的基因克隆及表达 姓名：吴欣竹 林小芳 专业：生物技术（生物制药） 学号：12110904010 12110904021 目录 摘要---------------------------------------------------------------------3 引言---------------------------------------------------------------------3 相关背景---------------------------------------------------------------4 实验原理---------------------------------------------------------------5 实验材料及试剂------------------------------------------------------7 实验流程---------------------------------------------------------------8 实验时间安排--------------------------------------------------------10 1.摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green?fluorescent?protein，GFP）基因在大肠杆中的基因克隆与重组表达。 方法:通过对目的基因的提取，合适质粒的选取，构建基因工程所需的重组体，利用基因工程的方法，PCR技术，大量克隆目的基因，最后利用合适的技术又到基因表达，对产物检测后，确定目的基因是否达到克隆目的。 关键词：绿色荧光蛋白 大肠杆菌 基因工程 PCR技术 2.引言 绿色萤光蛋白(green?fluorescent?protein)，简称GFP，是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP?发射绿色荧光。这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea?victoria的水母中发现。后来，美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。? 在生物学研究中，科学家们常常利用这种能自己发光的荧光分子来作为生物体的标记。将这种荧光分子通过化学方法挂在其他不可见的分子上，原来不可见的部分就变得可见了。生物学家一直利用这种标记方法，把原本透明的细胞或细胞器从黑暗的显微镜视场中“纠出来”。而且在一些方面，如分子标记、药物筛选、融合抗体、生物传感器等方面。除此之外，绿色荧光蛋白在很多的领域存在着巨大的前景。 本实验拟从含有GFP基因的生物中提取GFP基因，并在工程菌中克隆出该基因。 3.相关背景 绿色荧光蛋白（green?fluorescent?protein，GFP）? ? GFP研究背景? 绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP?发射绿色荧光。日本科学家下村修?1962年第一次从一种水母中发现了绿色荧光蛋白。??????? 这种蛋白在紫外线光中呈现绿色,?这种水母体内含有一种生物发光蛋白质——aequorin，但它本身发蓝光,通过对光谱的研究,?下村修提出了发光景水母所发的绿光是因激发的水母素向绿色荧光蛋白发生的荧光能量转移所致。即水母素作为一种能量供体,?而绿色荧光蛋白成为能量受体。水母素和绿色荧光蛋白都有重要的应用,?但水母素是荧光酶的一种,?它需要有荧光素底物,?经过酶促反应后发光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发的时候我们实际看到的颜色。其在阳光下呈绿色、?钨丝下呈黄色、?紫外光下呈现强烈绿色[2]。? 1987年，道格拉斯?普莱沙（Douglas?Prasher）克隆出了GFP的基因序列。1993年，在普莱沙的基础上，马丁?沙尔菲（Martin?Chalfie）成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物（如大肠杆菌等）也能产生GFP，这不仅证实了GFP与活体生物的相容性，还建立了利用GFP研究基因表达的基本方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿