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利用基因工程-技术表达蛋白质
第四章 利用基因工程技术表达蛋白质;第一节 基因工程原理简介;目的基因获得;第二节 基因工程中的方法学;真核细胞总RNA的电泳结果:;核酸电泳技术
1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS;二、一些重要技术原理介绍
重点介绍DNA双脱氧测序技术,核酸探针技术,PCR技术等。
(一)DNA双脱氧测序 ;;;;;(二)核酸杂交技术(probe)
1)原理; 2)标记物; 3)种类; 4)应用 ;1. Dot blot;2. Southern blot: DNA;3. Northern blot: RNA;Western blot: Protein;(三)PCR技术
1.基本原理
2.引物设计
1)长度; 2)GC%; 3)stem-loop;
4)dimer; 5)错配;
6)5’末端可以不配对
3.应用: 科学研究;医学与兽医临床。;DNA生物合成与PCR方法合成DNA的异同点:
1.相同点:均为酶促反应;均需要模板和引物;底物为dNTP;
半保留复制;均为5’ 3’方向复制。
2.不同点:
1)反应条件不同:体内为生理条件,体外为94℃、52℃及72 ℃
等变温条件;
2)参与反应的物质种类和数量不同;
3)引物不同,体内为RNA,体外为DNA,且在DNA合成后,前者
被切除掉,后者作为终产物的一部分;
4)体内为半不连续合成,体外为连续合成;
5)体内单复制原点或多复制原点,单方向或双方向复制;
6)体内受细胞周期的调控,体外按人们的意愿进行;
7)体内具有校正、修复的功能(错配率较低),体外无(错配
率较高);
8)体内DNA的复制为全部染色体DNA的复制,体外仅复制两引物
之间的DNA序列。;(四)目的基因的改造技术
1. 引物介导的基因定点突变技术
2. 盒式突变(cassette mutagenesis)
3. Genes Shuffling;三、基因工程中的工具
(一)载体
1.质粒(plasmid)
2.粘粒(cosmid)
3.λ噬菌体(λ phage)
(二)工具酶
1.限制性内切酶
2.外切酶
3.连接酶
4.聚合酶: klenow I
5.核酸酶
(三)宿主菌 DH5?, JM101, JM109; DE3等;;四、获得目的基因的方法
基因文库(基因组文库和cDNA文库),化学合
成,PCR 等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技
术。
(一)基因组文库
目的:种质资源的保护;基因组测序;基因组
基因或调控序列的克隆等。; 家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆
和序列分析 ;特异性探针;结果1:;结果2:;2.0 ; 1 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100
101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200
201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300
301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400
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