利用基因工程-技术表达蛋白质.ppt

第四章 利用基因工程技术表达蛋白质;第一节 基因工程原理简介;目的基因获得;第二节 基因工程中的方法学;真核细胞总RNA的电泳结果：;核酸电泳技术 1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS;二、一些重要技术原理介绍 重点介绍DNA双脱氧测序技术，核酸探针技术，PCR技术等。 （一）DNA双脱氧测序 ;;;;;(二)核酸杂交技术（probe） 1）原理； 2）标记物； 3）种类； 4）应用 ;1. Dot blot;2. Southern blot： DNA;3. Northern blot: RNA;Western blot: Protein;（三）PCR技术 1.基本原理 2.引物设计 1)长度; 2)GC%; 3)stem-loop; 4)dimer; 5)错配; 6)5’末端可以不配对 3.应用: 科学研究；医学与兽医临床。;DNA生物合成与PCR方法合成DNA的异同点: 1.相同点：均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为dNTP； 半保留复制；均为5’ 3’方向复制。 2.不同点： 1）反应条件不同：体内为生理条件，体外为94℃、52℃及72 ℃ 等变温条件； 2）参与反应的物质种类和数量不同； 3）引物不同，体内为RNA，体外为DNA，且在DNA合成后，前者 被切除掉，后者作为终产物的一部分； 4）体内为半不连续合成，体外为连续合成； 5）体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制； 6）体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行； 7）体内具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配 率较高）； 8）体内DNA的复制为全部染色体DNA的复制，体外仅复制两引物 之间的DNA序列。;（四）目的基因的改造技术 1. 引物介导的基因定点突变技术 2. 盒式突变(cassette mutagenesis) 3. Genes Shuffling;三、基因工程中的工具 （一）载体 1.质粒(plasmid) 2.粘粒(cosmid) 3.λ噬菌体(λ phage) （二）工具酶 1.限制性内切酶 2.外切酶 3.连接酶 4.聚合酶: klenow I 5.核酸酶 （三）宿主菌 DH5?, JM101, JM109; DE3等;;四、获得目的基因的方法 基因文库（基因组文库和cDNA文库），化学合 成，PCR 等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技 术。 （一）基因组文库 目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组 基因或调控序列的克隆等。; 家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆 和序列分析 ;特异性探针;结果1:;结果2:;2.0 ; 1 ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA 100 101 ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT 200 201 AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA 300 301 ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA 400 401 TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT 500 501 TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT 600 601 TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGG