双向电泳实验方法.doc

1 双向电泳中叶片蛋白质不同提取方法比较 1.1三氯乙酸/丙酮法(TCA/acetone法):取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加5ml含0.2%DTT和20%TCA的冷丙酮溶液匀浆，放置于-20℃冰箱过夜。之后4℃下13000rpm离心30min，弃上清液，沉淀用含0.2%的丙酮溶液清洗三次(每次均放于-20℃冰箱沉淀1h)。最后沉淀冻干，放于-80℃冰箱待用。 1.2 DTT/丙酮法:取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加5ml含2%DTT的水溶液匀浆。之后4℃下1000rpm离心30min，取上清液，弃沉淀。上清液加4倍体积的冷丙酮，放置于-20℃冰箱过夜。之后4℃下13000rpm离心30min，沉淀用80%丙酮溶液清洗三次(每次均放于-20℃冰箱沉淀1h)。最后沉淀冻干，放于-80℃冰箱待用。 1.3 酚提取法:取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加3ml提取液(1%PVPP,0.7M蔗糖,0.1M KCL,0.5M pH7.5 Tris-HCL,500mM EDTA,1Mm PMSF,2%β-巯基乙醇)，4℃下1000rpm离心30min，取上清液加等体积的Tris酚，4℃下放置30min，之后10000 rpm离心15min，取酚相上清液。此过程反复提取2-3次。最后酚相用5体积0.1M冷乙酸铵溶液-20℃沉淀过夜。之后13000 rpm离心30min, 沉淀用0.1M冷乙酸铵溶液清洗三次,再用冷丙酮洗一次, 最后沉淀冻干,放于-80℃冰箱待用。 1.4 三氯乙酸/丙酮法/酚（TCA/acetone/phenol）提取法: 取1g植物叶片，液氮冷冻研磨, 加4ml冷丙酮, 4℃下13000rpm离心3min，再用冷丙酮洗两次并离心。沉淀转入研钵中,室温干燥20min。干粉末重新研得更细，并转到新管中，得到得组织粉末用10%冷TCA/丙酮溶液清洗3-4次，直到上清液无颜色为止。最后用80%冷丙酮洗两次，每次沉淀彻底重新旋弃，并离心。 取0.05~0.1g干粉末在2.0ml管里重新悬浮于0.8mlTris酚和0.8mlSDS溶液(含30%蔗糖,2%SDS,0.1M Tris-HCL Ph8.0, 5%β-巯基乙醇)中。该混合物彻底涡旋30S, 4℃下13000rpm离心30min， 酚相移到新管中，用5体积0.1M冷乙酸铵溶液-20℃沉淀过夜。之后13000 rpm离心30min，沉淀用0.1M冷乙酸铵溶液清洗两次，再用80%冷丙酮洗两次，最后沉淀冻干，放于-80℃冰箱待用。 2 蛋白质分离的双向电泳过程 2．1溶液配制 常用水化上样缓冲液 （Ⅰ） 尿素 8M 4.805g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml （Ⅱ） 尿素 7M 4.2g 硫脲 2M 1.52g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水 定容至100ml (Ⅲ) 尿素 5M 3.0g 硫脲 2M 1.52g SB3-10 2% 0.2g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098